Національний фармацевтичний університет Проблеми клініки, діагностики та терапії гепатитів Збірник праць науково практичної конференції Харків 2005
| Вид материала | Диплом |
СодержаниеЦитотоксическое и иммуносупрессивное Влияние опиатов на клеточное звено иммунной системы у наркопотребителей с вирусными гепатит |
- Матер І а л и науково-практичної конференції з міжнародною участю 1-2 березня 2007, 7242.75kb.
- Наукова програма передбачає науково-практичні доповіді та постерну сесію з обговоренням, 40.36kb.
- Міропольська М. А., Капченко Л. М., Алєксєєва А. В., Савченко, 7248.82kb.
- Хx міжнародної Науково-практичної конференції Інформаційні технології: Наука, техніка,, 1555.53kb.
- Хix міжнародної Науково-практичної конференції Інформаційні технології: Наука, техніка,, 1754.6kb.
- Хvii міжнародної Науково-практичної конференції Інформаційні технології: Наука, техніка,, 1402.07kb.
- Хviii міжнародної Науково-практичної конференції Інформаційні технології: Наука, техніка,, 1642.96kb.
- Запорізька облдержадміністрація запорізька обласна рада запорізький національний університет, 6793.22kb.
- Всеукраїнська федерація «спас» запорізька облдержадміністрація запорізька обласна рада, 3474.89kb.
- Міністерство аграрної політики України Львівський національний аграрний університет, 48.27kb.
Цитотоксическое и иммуносупрессивное Влияние опиатов на клеточное звено иммунной системы у наркопотребителей с вирусными гепатитами
Бондаренко А.Н.
Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В. Громашевского, АМН Украины. г. Киев
Уровень наркопотребителей в структуре парентеральных вирусных гепатитов (ВГ) неуклонно растет, достигая 60-80 % [1,3,4], а ВГ становятся маркером наркопотребления. Известно, что опиаты влияют практически на все системы макроорганизма [2,5], и являясь нейромедиаторами, обеспечивают взаимодействие нейроэндокринной системы с иммунной и системой интерферонов [5]. Большинство исследователей указывают на иммуносупрессивное влияние как эндогенных, так и экзогенных опиатов [3,4,6,7]. Иммунная система играет ведущую роль в патогенезе парентеральных ВГ, определяя тяжесть течения, цикличность и исходы ВГ [3,4]. Механизмы иммунной регуляции цитолиза при ВГ многокомпонентны и сложны, а при ВГ у наркопотребителей вообще не изучены. Поэтому целью работы было изучение влияния опиатов на иммуноциты и на основании полученных данных объяснить некоторые особенности патогенеза и клиники ВГ у наркопотребителей.
Материалы и методы. Обследовано 30 наркозависимых больных с парентеральными ВГ (основная группа), 20 больных ВГ, не употребляющих наркотики (контрольная группа) и 20 клинически здоровых лиц (доноры). Возраст обследованных составил 18-36 лет. В основной и контрольной группах все обследованные были мужчинами. Основную и контрольную группы составляли больные парентеральными моно- и микст-гепатитами (B, C, В+С, В+D, В+С+D) с тяжелым (30 %), среднетяжелым (50 %) и легким течением (20 %). Обе группы были репрезентативны по основным параметрам. В рамках действующего законодательства в качестве опиатов использованы остатки "суррогатов опия" и морфина гидрохлорида (до 0,1 мл), оставленные наркопотребителями в выброшенных пластиковых шприцах и ампулах от фармакологических препаратов сразу после введения наркотиков. Объект исследований - мононуклеары, выделяли из венозной крови на градиенте плотности (р=1,077 г/см3) [8]. В исходную взвесь клеток 0,1мл в среде 199 (2х106/мл) добавляли равное по объему количество исследуемого опиата в различных разведениях от 1:10 до 1:100.000 от исходной. Взвесь инкубировали при 370 С в течение 60 минут, после чего центрифугировали при 1000 об/мин в течение 15 минут. Для оценки токсического влияния различных концентраций опиатов на мононуклеары изучали их жизнеспособность. Суспензию суправитально окрашивали 0,1 % раствором трипанового синего [8], определяя уровень нежизнеспособных клеток. Оценивали также влияние опиатов на презентацию рецепторов на Т-лимфоцитах. Модель базировалась на способности Т-клеток под действием иммуномодуляторов изменять на мембране презентацию рецепторов к эритроцитам барана [8]. Концентрация опиатов в среде инкубации была подобрана с учетом их влияния на жизнеспособность мононуклеаров так, чтобы уровень погибших клеток не превышал 5 % (необходимое условие базовой методики [8]). Полученные данные обработаны при помощи методов математической статистики.
Собственные исследования. Учитывая то, что большинство наркопотребителей используют суррогаты опия, для максимального приближения условий эксперимента к реальным на первом этапе необходимо было изучить влияние на иммуноциты именно опийных суррогатов. Кустарно изготовленные препараты опия экстрагируются из первичного сырья органическими растворителями с дальнейшей химической модификацией уксусным ангидридом с целью получения диацетилморфина (героина) [2] и большинство производителей опийных суррогатов в нашем регионе придерживаются этой схемы. Поэтому с определенной вероятностью можно было рассчитывать на некоторую "стандартизацию" этих опиатов. В проведенном исследовании изучения влияния суррогатов опия на мононуклеары периферической крови больных ВГ и доноров четко прослеживались две тенденции: зависимость токсичности от образца наркотика и его концентрации в культуральной среде. Оказалось, что даже в достаточно высоких разведениях 1:10.000 (0,5 мкг/мл) и 1:100.000 (0,05 мкг/мл) суррогаты опия были высокотоксичными для иммуноцитов. Уровень нежизнеспособных клеток после инкубации с суррогатами опия в этих разведения, колебался в достаточно широких пределах - от 10 до 65 %. Такие широкие границы изменения показателей не давали возможности для статистического анализа и получения достоверных данных. С повышением концентрации суррогата в среде инкубации логично повышалась и его токсичность. Однако степень токсичности жестко зависела только от исследуемого образца опиата, что также не позволяло провести статистическую обработку данных. Для иллюстрации необходимо привести данные по терапевтической, токсической и летальной концентрации морфина в плазме крови человека, которые соответственно составляют – 0,08-0,12; 0,15-0,50 и 0,5- 4,0 мкг/мл [2]. Необходимо также указать, что, несмотря на невозможность статистической обработки, полученных данных по токсичности отдельных образцов суррогатов опия, их токсичность была выше для для лиц, не употребляющих наркотики по сравнению с наркопотребителями. Однако и этот показатель был достаточно вариабелен.
Получив данные о высокой токсичности суррогатов опия и предварительные данные о более высокой толерантности иммуноцитов наркопотребителей к опиатам по сравнению с больными контрольной группы и донорами, необходимо было на следующем этапе исследований изучить влияние на жизнеспособность мононуклеаров основного компонента суррогатов опия – фармакологического морфина, а также изучить его иммуномодулирующее действие на иммуноциты. Данные зависимости цитотоксичности морфина от его концентрации в среде инкубации мононуклеаров приведены в таблице 1.
Анализ показал, что не зависимо от группы пациентов цитотоксичность морфина для мононуклеаров возрастает с ростом его концентрации в среде инкубации иммуноцитов. Зависимость имеет сложный нелинейный характер. В концентрациях 0,05 и 0,1 мкг/мг, которые соответствуют "терапевтическому" уровню морфина в сыворотке крови морфин практически не проявлял цитотоксичности. Только у больных ВГ, не употребляющих наркотики, и у доноров уровень нежизнеспособных клеток при концентрации морфина 0,1 мкг/мл незначительно превысил 5 % барьер, а у наркопотребителей он не превысил 5 % и был достоверно ниже показателей у обычных больных ВГ.
Уровень погибших иммуноцитов становился значимым уже с "токсической" концентрации (0,5 мкг/мл) во всех группах обследованных и составлял уже 14-28 %. Следует сразу отметить, что, начиная с концентрации морфина 0,5 мкг/мл, отмечены достоверные отличия в уровне погибших мононуклеаров в группах. Так у наркопотребителей этот показатель был в 2 раза ниже по сравнению с обычными больными ВГ. С ростом концентрации морфина в культуральной среде достоверность различия в указанных группах сохранялась, но была уже менее значимой, а при уровне морфина 500 мкг/мл уровень нежизнеспособных клеток составил почти 70 % и уже не имел статистически достоверного различия в исследуемых группах. Необходимо также отметить, что достоверных отличий в уровне нежизнеспособных иммуноцитов в случае инкубации клеток при одинаковых концентрациях морфина в группе доноров и больных ВГ, не употребляющих наркотики, не отмечено. Полученные данные четко иллюстрируют то, что устойчивость мононуклеаров у наркопотребителей к цитотоксическому действию высоких концентраций морфина достоверно выше, чем у лиц, не употребляющих наркотики.
Степень цитотоксичности морфина для мононуклеаров периферической крови у больных ВГ и клинически здоровых лиц (X + )
Конечная концентрацияморфина в средеинкубации | Процент нежизнеспособных мононуклеаровпосле инкубации с морфином | ||
Больные ВГ,употребляющие наркотики | Больные ВГ, не употребляющие наркотики | Доноры | |
500 мкг/мл | 63,15 + 3,41, | 66,86 + 3,94, | 67,15 + 3,78, |
100 мкг/мл | 47,29 + 3,54*,**,, | 56,75 + 3,81*,, | 58,16 + 3,29**,, |
50 мкг/мл | 42,94 + 3,58*,**, | 51,04 + 3,28*,, | 51,36 + 3,39**,, |
10 мкг/мл | 39,53 + 3,15, | 47,11 + 3,36*, | 42,18 + 3,65 |
5 мкг/мл | 32,06 + 2,82*,**,, | 40,59 + 3,01*,, | 40,15 + 3,19**,, |
0,5 мкг/мл | 14,15 + 3,39*,**,, | 27,92 + 3,12*,, | 26,19 + 2,98**,, |
0,1 мкг/мл | 4,14 + 0,89 | 6,17 + 0,95 | 5,83 + 0,81 |
0,05 мкг/мл | 3,65 + 0,69 | 5,14 + 0,85 | 4,45 + 0,79 |
Контроль токсичностисреды и условий инкубации | 3,78+ 0,69 | 3,53 + 0,91 | 3,27 + 0,78 |
Примечание: *,** - показатели достоверности различия, сравниваемых показателей в группах (в строке) p < 0,05; , - достоверное различие между показателями в колонке (р<0,05)
Следующим этапом исследований было изучение иммуномодулирующего действия морфина. Была использована концентрация морфина в культуральной среде – 0,1 мкг/мл, которая не оказывала цитотоксический эффект и являлась пограничной между "терапевтической" и "токсической" концентрациями. В случае применения более высоких доз морфина заранее можно было ожидать снижения рецепторной презентации на мононуклеарах за счет высокого уровня нежизнеспособных клеток. Применение именно пограничной концентрации морфина для лиц, не употребляющих наркотики в изучении иммуномодуляции в исследуемых группах и толерантность наркопотребителей к высоким дозам опиатов, делало оптимальным и репрезентативным использование в методике морфина в дозе равной 0,1 мкг/мл. Она удовлетворяла основному требованию метода изучения иммуномодулирующих свойств различных препаратов – использование нетоксичных терапевтических их концентраций, аналогичных образующимся в тканях при введении препаратов в разовых терапевтических или суточных дозах. Кроме этого метод предполагает использование пула мононуклеаров с уровнем нежизнеспособных клеток не превышающим 5-6 % [8]. Этому условию и соответствовали данные предыдущего этапа исследований по концентрации морфина 0,1 мкг/мл. Данные по влиянию морфина на презентацию мембранных рецепторов Т-клетками в исследуемых группах и доноров приведены в таблице 2.
Во всех группах инкубация Т-клеток с морфином приводила к достоверному снижению уровня розеткообразующих клеток (Е-РОК), а следовательно к снижению экспрессии мембранных рецепторов к эритроцитам барана. Но достоверных отличий между группами в уровне Е-РОК как до, так и после инкубации с морфином не отмечено. Учитывая это, необходимо было изучить степень снижения уровня Е-РОК, которую можно оценить, рассчитав индекс чувствительности к иммуномодулятору равный, выраженному в процентах, соотношению уровня Е-РОК после инкубации с иммуномодулятором к уровню Е-РОК при инкубации без него [8]. Оказалось, что у больных контрольной группы и доноров степень снижения равнялась 25-27 %, а у наркопотребителей была достоверно ниже почти в 2 раза. Приведенные данные иллюстрируют иммуносупрессивное влияние морфина во всех группах. Однако, как и в случае изучения цитотоксичности высоких концентраций морфина, иммуноциты наркопотребителей оказались более устойчивыми к иммуносупрессивному влиянию морфина.
Влияние морфина на уровень презентации рецепторов на мононуклеарах периферической крови больных вирусными гепатитами и доноров (X + )
Группы больных(n-число пациентов) | УровеньЕ-РОК% | Уровень Е-РОКс морфином% | Индексчувствительности % |
Больные ВГ, употребляющие наркотики (n=20) | 50,57 + 3,69*, | 45,09 + 3,37* | - 14,32 + 2,82, |
Больные ВГ, не употребляющие наркотики (n=15) | 55,31 + 3,25* | 42,14 + 3,05*,** | - 24,89 + 2,43 |
Клинически здоровые лица (n=15) | 58,11 + 2,74*, | 41,59 + 2,07* | - 26,75 + 2,67 |
Примечание: *, ** - достоверное различие между показателями в строке (р<0,05)
, - достоверное различие между показателями в колонке (р<0,05)
Обсуждение. Полученные данные показали, что опиаты в целом оказывают иммуносупрессивное влияние на Т-клеточное звено иммунной системы. Опиаты могут оказывать прямое токсическое действие на мононуклеары, что напрямую зависит от их концентрации в среде инкубации и тканях макроорганизма, а также от толерантности к наркотикам у наркопотребителей. Необходимо особо отметить, что у наркозависимых больных устойчивость иммуноцитов к токсическому действию опиатов в 2 раза выше, чем у здоровых лиц.
Механизм иммуносупрессии опиатов при ВГ можно объяснить их прямым токсическим влиянием на иммуноциты. В первую очередь это относится к суррогатам опия. Суррогаты опия высокотоксичны, однако степень их токсичности крайне вариабельна и скорее всего зависит не столько от концентрации морфина и героина, а от токсичности примесей или "добавок" в суррогатном наркотике. Инкубация мононуклеаров в среде с "терапевтическими" концентрациями чистого морфина также снижала уровень презентации рецепторов на мембране лимфоцитов, а следовательно приводила к снижению функциональной активности иммуноцитов и снижению их потенции к межклеточному взаимодействию и кооперации. Поэтому, можно с уверенностью говорить, что механизмы иммуносупрессии опиатов реализуются за счет, как их прямой цитотоксичности, так и способности угнетать функциональную активность мононуклеаров. Полученные данные также не противоречат данным литературы [3,4,6,7]. Однако, показав иммуносупрессию морфина, его использовали в экспериментах на культурах мононуклеаров здоровых лиц в цитотоксичной концентрации [6,7], что уже изначально предопределяло механизм иммуносупрессии. Но это не было отражено в публикациях и следовательно не могло быть достаточно достоверным и достаточным условием для интерполяции этих данных на группу наркопотребителей с ВГ с повышенной толерантностью к цитотоксичности опиатов. Необходимым условием подтверждения иммуносупрессивного влияния опиатов у наркопотребителей с ВГ было клиническое подтверждение экспериментальных данных. Таким обоснованием стала абстиненция, оказывающая негативное влияние на течение ВГ у наркопотребителей [1]. Купирование абстиненции с применением заместительной терапии опиатами или агонистами опиатных рецепторов приводит к быстрому обратному развитию клинического ухудшения, развившегося на фоне абстиненции [1]. Клиническое ухудшение при ВГ напрямую связано с активацией цитолиза, обусловленного иммунным лизисом гепатоцитов и прямым токсическое действием суррогатов опия. При абстиненции токсичного фактора активации цитолиза нет и он обусловлен активацией иммунного лизиса гепатоцитов, что, скорее всего, связано с отменой опиатной иммуносупрессии. Подтверждением этому может служить эффективность применения глюкокортикоидов в терапии ВГ на фоне абстиненции. Логичным становится вывод - отмена наркотика соответствует отмене иммуносупрессии. Следовательно, опиаты и являются тем иммунодерессантом, отмена которого активизирует цитолиза. Подтверждением иммуносупрессии опиатов были и собственные клинические наблюдения. Так гнойно-воспалительные процессы у наркопотребителей протекают с умеренной интоксикацией и выраженной тенденцией к локализации. У таких больных "системный" иммунный ответ, опосредованный лимфоцитами как бы заторможен.
В заключение следует сказать, что полученные данные позволили экспериментально и клинически показать иммуносупрессивное действие опиатов и объяснить отдельные механизмы этой иммуносупрессии.
Выводы. Суррогаты опия обладают высокой цитотоксичностью для иммуноцитов и выраженным иммуносупрессивным влиянием. Цитотоксичность морфина для иммуноцитов зависит от его уровня в среде инкубации клеток и возрастает с ростом его концентрации. Механизмом иммуносупрессии морфина, является снижение презентации мембранных рецепторов на Т-лимфоцитах и цитотоксичность высоких концентраций морфина для иммуноцитов (у наркопотребителей). Наркопотребители по сравнению с лицами, не употребляющими наркотики, обладают более высокой толерантностью к цитотоксическому и иммуносупрессивному действию морфина и суррогатов опия на иммуноциты.