Хламидиоз
| Вид материала | Документы |
- Лекции по дерматовенерологии к элективному курсу «Инфекции, передающиеся половым путем», 28.12kb.
- Урогенитальный хламидиоз: клинико-иммунологическая характеристика, иммуногенетические, 872.18kb.
- Книга посвящена актуальным вопросам гинекологии, венерологии и урологии. Освещены наиболее, 71.68kb.
- Влияние скэнар-терапии на течение беременности, родов, состояние новорожденного и ребенка, 146.76kb.
- 18 февраля в Республике Беларусь проводится День профилактики инфекций, передающихся, 16.66kb.
Диагностика хламидий методом гибридизации ДНК
Для определения ДНК хламидий часто используют весьма информативный метод точечной гибридизации (дот гибридизации) нуклеиновых кислот на твердой фазе с использованием ДНК-зонда, меченного биотином. Из исследуемых образцов выделяют суммарную ДНК. Образцы исследуемой ДНК и контрольные образцы денатурируют кипячением, фиксируют на нитроцеллюлозном фильтре и гибридизуют с предварительно денатурированным биотинированным ДНК-зондом. Не связавшийся зонд удаляют путем отмывки фильтра. На следующем этапе фильтр обрабатывают коньюгатом страптавидина с щелочной фосфатазой. На заключительном этапе вносят субстратный раствор. Окрашивание соответствующих точек свидетельствует о наличии тестируемой ДНК в исследуемом материале.
Рабочие растворы готовят согласно инструкции предприятия изготовителя тест-системы. Гинекологические мазки переводят в физиологический раствор и центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин., надосадочную жидкость сливают, а оставшуюся суспензию клеток хранят в замороженном виде до проведения анализа.
^ Проведение анализа:
В чашку Петри с 10-15 мл дистиллированной воды помещают нитроцеллюлозный фильтр на 5-10 мин до полного смачивания. Мокрый фильтр переносят в другую чашку с 4 мл раствора 10xSSC. выдерживают 10 минут и подсушивают на воздухе на фильтровальной бумаге.
100 мкл суспензии клеток анализируемого материала смешивают с равным объемом лизирующего раствора, тщательно перемешивают и выдерживают 3 часа при 37-40°С и 5 мин при 60°С. Затем добавляют 0,05 мл ацетата калия, перемешивают и выдерживают 30 мин при 0 - 4°С, после чего центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок перемешивают на воздухе и растворяют в 10 мкл раствора 10xSSC Подготовительные пробы, положительный и отрицательный контроли денатурируют на кипящей водяной бане и течение 10 мин, затем быстро переносят пробирки в баню лед-вода на 5 мин и наносят па подготовленный фильтр по 2 мкл в пятно, фильтр высушивают на воздухе и запекают при 80°С в течение 2 часов.
Далее фильтр с пробами смачивают в дистиллированной воде, переносят в чашку Петри и заливают сверху 10 мл блокирующего раствора. Фильтр инкубируют 1 час при комнатной температуре на качалке, затем блокирующий раствор сливают и фильтр заливают 5 мл гибридизационного раствора. При этом необходимо тщательно закрыть чашку Петри для избежания испарения гибридизационного раствора. Гибридизацию проводят при 42о С в течение 12-15 ч в термостате. Фильтр отмывают от несвязавшегося зонда путем трехкратной инкубации при комнатной температуре по 10 мин в промывочном растворе. Далее фильтр инкубируют 15 мин в водяной бане при температуре 60о С в промывочном растворе и один раз в течение 5 мин при комнатной температуре в растворе TST.
Для блокирования неспецифического связывания коньюгата фильтр заливают 10 мл раствора для блокирования и выдерживают 0,5 ч при комнатной температуре на шейкере. Далее фильтр ополаскивают раствором TST и выдерживают в 6 мл рабочего раствора коньюгата в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем фильтр 3 раза по 10 мин промывают в растворе TST и один раз в растворе для приготовления проявляющей смеси. Фильтр заливают 5 мл проявляющей смеси с субстратом и хромогеном и выдерживают в темноте при 20о С в течение нескольких часов до появления окраски. Фильтр промывают дистиллированной водой для остановки проявления и высушивают.
Учет результатов:
Результаты гибридизации оценивают визуально путем сравнения с интенсивностью окраски пятен контрольных проб. Положительными считаются образцы, имеющие окраску пятна, отчетливо отличающуюся вследствие большей интенсивности от фоновой окраски.
^ Таблица 18. Выявление Chlamydia trachomatis методом культурального посева
| Методы детекции | Выявление хламидий (в %) |
| ПИФ | 94 |
| ПЦР | 96,2 |
^ Таблица 19. Выявление Chlamydia tracomatis прямыми методами исследования (ПИФ, ПЦР, ИФА)
| Методы детекции | Выявление хламидий (в %) |
| ПИФ | 68,9 |
| ПЦР | 94,8 |
| ИФА | 25,62 |
^ Таблица 20. Достоинства и недостатки различных методов обнаружения Chlamydia trachomatis
(Taylor-Robinson О., Thomas B.J ,1991, с дополнениями Говорун В.М, Бочкарев Е.Г., Парфенова Т.М., 1999)
| Характеристика/ Метод | ПИФ | Культуральный посев | ИФА-методы | ПЦР |
| Исследуемый материал | Любой | Большинство | Ограничения из-за неспецифичности реакций | Любой |
| Значение правильно взятых проб | Решающее | Решающее | Решающее | Решающее |
| Условия транспортировки проб | Если препарат фиксирован -условия не важны | Быстрая доставка или хранение при низкой температуре | Не имеет значения, если проба взята в буфер | Быстрая доставка или хранение при низкой to менее важно, чем для культуры клеток |
| Условия хранения | На короткое время при +4°С длительно при -20 °С | +4°С - сутки-двое. Длит хранение в жидком азоте | 3 -5 дней при +4°С Замораживание снижает чувствительность | На короткое время + 4°С, две недели - 20°С Длительное время - в жидком азоте |
| Проверка адекватности взятия материала | Мазки оценивают во время тестирования | Не практикуется | Не практикуется | Определяется, присутствует ли ДНК. |
| Потребность в специальном оборудовании | Люминесцентный микроскоп | Центрифуга | Комплект для ИФА | Амплификатор и оборудование для электрофореза |
| Обработка проб | Простая | Трудоемкая | Становится проще для новых тестов | Требует строгой предосторожности, чтобы не контаминировать ДНК |
| Чтение результатов | Субъективное и утомительное | Субъективное умеренно утомительное | Объективное, Простое | Объективное, простое |
| Время выполнения | 30 минут | 12-72 часа | 3 часа | 4,5-5 часов |
| Способы проверки результатов | Повторный просмотр | Повторный просмотр | Повторение теста | Повторная проба или переваривание эндонуклеазой |
| Результат зависит от следующих причин: | Опыта микроскописта | Чувствительности клеточной культуры | Присущей мощности теста | Требует хорошего контроля и отсутствия контаминации |
| Способность к поддержанию штамма | Нет | Да | Нет | Нет |
| Использование как контроля эффективности лечения | Ограничено | Рекомендуется | Ограничено | Рекомендуется с ограничениями |