Цитогенетическое исследование культур лимфоцитов периферической крови людей в отдаленные сроки после острого внешнего облучения 03. 00. 01 радиобиология

Вид материала

Исследование

Содержание Научный руководитель Снигирёва Галина Петровна Общая характиристика работы Содержание работы Культивирование лимфоцитов периферической крови и приготовление препаратов хромосом Статистическая обработка результатов. Компьютерный метод ретроспективной оценки дозы. 1. Изучение элиминации аберраций хромосом у лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС 2. Ретроспективная оценка дозы радиационного воздействия с помощью компьютерного метода у лиц, пострадавших при аварии на Черноб 4. Частоты хроматидных аберраций в отдалённые сроки после облучения у лиц, пострадавших при различных радиационных ситуациях Список работ, опубликованных по теме диссертации Дудочкина Н.Е.

Подобный материал:

• Дипломная работа, 517.35kb.
• Закономерности поведения 90 Sr и 137 Cs в озерных экосистемах восточно-уральского радиоактивного, 553.47kb.
• Одной из актуальных задач ветеринарной науки является решение проблемы лейкоза крс, 43.16kb.
• Темы лекционной программы по дисциплине «радиобиология» для специальности «Стандартизация, 916.27kb.
• Рабочая учебная программа по дисциплине Гематология Для специальности, 174.73kb.
• Влияние гипо- и гиперпаратиреоза на особенности организации циркадианных ритмов состава, 234.16kb.
• Материалы для подготовки к семинарским занятиям по дисциплине «радиобиология», 1123.19kb.
• Лечение больных с гнойно-некротическими процессами при синдроме диабетической стопы, 258.22kb.
• Материалы предоставлены интернет проектом www diplomrus, 183.13kb.
• Состояние нуклеолярного аппарата лимфоцитов крови при профессиональном воздействии, 366.29kb.

Федеральное государственное учреждение

«Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна»

ФМБА России


На правах рукописи


Дудочкина Наталья Евгеньевна


ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КУЛЬТУР

ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЛЮДЕЙ

В ОТДАЛЕННЫЕ СРОКИ ПОСЛЕ ОСТРОГО ВНЕШНЕГО

ОБЛУЧЕНИЯ


03.00.01 – радиобиология


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук


Москва – 2009

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении «Федеральный

медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна» ФМБА России


^ Научный руководитель:

доктор биологических наук Нугис Владимир Юрьевич


Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Домрачёва Елена Васильевна

кандидат биологических наук ^ Снигирёва Галина Петровна


Ведущая организация: Институт медико-биологических проблем РАМН


Защита состоится «__5___» ______марта_____ 2009 г. в __10_ час _00_ мин на заседании диссертационного совета Д 462.001.01 при Федеральном медицинском биофизическом центре им. А.И. Бурназяна ФМБА России по адресу 123182, г. Москва, ул. Живописная, д. 46


С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального медицинского биофизического центра им. А.И. Бурназяна ФМБА России


Автореферат разослан «_29__» ___января___ 2009 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета Д 462.001.01,

доктор медицинских наук Н.К.Шандала

^ ОБЩАЯ ХАРАКТИРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность темы.

Необходимость развития атомной энергетики и широкое использование в промышленности и медицине источников ионизирующих излучений сопровождались и сопровождаются риском возникновения радиационных аварий с появлением пациентов, подвергшихся радиационному воздействию в тех или иных дозах, в том числе и приводящих к развитию у них острой лучевой болезни (ОЛБ). Соответственно появилась необходимость диагностики самого факта переоблучения и оценки поглощённых доз с целью прогнозирования тяжести ОЛБ и осуществления её адекватной терапии.

На практике для своевременного получения данных о дозовых нагрузках на пострадавших при радиационных авариях, необходимо комплексное использование методов, как физической дозиметрии, так и биологической индикации дозы. В области использования последней к настоящему времени накоплен огромный опыт, совершенствуются прежние и появляются новые методы определения дозовых нагрузок на человека.

Наиболее доступным и достоверным биологическим методом оценки действия ионизирующего излучения (помимо исследования ЭПР-сигнала в эмали зуба) на современном этапе является цитогенетический метод. Анализ аберраций хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови является общепризнанным методом биологической индикации дозы и применяется на практике в случаях радиационного поражения людей уже более 40 лет. Метод хорошо разработан для случаев внешнего острого относительно равномерного облучения при условии его использования в ближайшие сроки после радиационного воздействия. Огромную роль цитогенетический анализ сыграл в ситуации аварии на ЧАЭС, когда в начальный период он явился практически единственным источником сведений о дозовых нагрузках на пострадавших.

Одной из проблем, всегда стоявших перед методами цитогенетической индикации дозы, также была ее оценка в отдаленные сроки после радиационного поражения. Ретроспективная оценка дозы нужна для верификации факта облучения и определения тяжести радиационного поражения в целях проведения адекватной медико-социальной экспертизы, если в ближайшие сроки после облучения дозиметрическое исследование по тем или иным причинам не проводилось. Важное значение также имеет определение канцерогенного и генетического риска для людей, непосредственно подвергшихся воздействию ионизирующего излучения. Отсутствие достоверных данных о поглощенных дозах создает объективные трудности при решении этой проблемы.

При аварии на ЧАЭС большое число лиц подверглись тотальному облучению в широком диапазоне доз, и у многих из них был осуществлен цитогенетический анализ культур лимфоцитов в ближайшие сроки после радиационного воздействия. Это привлекло внимание к данному контингенту, как к источнику сведений, пригодных для уточнения закономерностей элиминации аберраций хромосом и разработки методов ретроспективной оценки дозы. Такое исследование было начато, однако оно было ограничено временем не более 5 лет после облучения (В.Ю.Нугис,.2003). Судьба же аберраций хромосом в более отдаленные сроки так же представляет значительный интерес, т.к. несмотря на наличие FISH-метода изучение возможности использования для ретроспективной оценки дозы нестабильных аберраций хромосом остается актуальной.

Цель работы.

Оценить возможность ретроспективной индикации дозы с помощью классического метода окраски хромосом по результатам исследования культур лимфоцитов периферической крови в отдалённые сроки (преимущественно больше 5 лет) после острого внешнего облучения пациентов, пострадавших при различных радиационных авариях.

Задачи.

1. Провести анализ аберраций хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови у лиц, пострадавших в результате аварии на Чернобыльской АЭС, в отдаленные сроки (больше 5 лет) после облучения.
   
2. Путём сравнения полученных данных с результатами ранее выполненных (в том числе и в ближайшие сроки после аварии на Чернобыльской АЭС) исследований изучить закономерности элиминации различных типов аберраций хромосом.
   
3. Осуществить анализ аберраций хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови у пациентов, пострадавших при различных (кроме аварии на Чернобыльской АЭС) радиационных инцидентах.
   
4. Использовать специальную компьютерную программу, разработанную доктором биол. наук И.В.Филюшкиным, для восстановления величины полученной дозы из распределений клеток по числу содержащихся в них аберраций хромосом в отдалённые сроки у лиц, пострадавших в результате различных радиационных аварий.
   
5. На основании полученных результатов оценить возможность ретроспективной оценки дозы при применении классического метода анализа аберраций хромосом, используя имеющиеся сведения о первоначальных оценках дозы.
   

Новизна исследования.

Работа основана на изучении в течение длительного времени с помощью классического цитогенетического метода нестабильных аберраций хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови у достаточно однородного контингента больных, подвергшихся облучению в сходных условиях во время аварии на Чернобыльской АЭС, у которых имеются данные исследования хромосомных аберраций в ближайшие сроки после воздействия и госпитализированных для динамического наблюдения и проведения необходимых исследований со значительной повторностью. Это дало возможность впервые изучить закономерности элиминации аберраций хромосом в отдаленные сроки (примерно от 5 до 20 лет) после облучения и оценить перспективы их использования для ретроспективного определения дозы воздействия. Ранее подобное исследование данного контингента было осуществлено спустя не более 5 лет после облучения. Также впервые проведено цитогенетическое обследование в широком диапазоне времени (до примерно 50 лет после облучения) лиц, пострадавших при других радиационных авариях. На всём этом материале был апробирован оригинальный компьютерный метод ретроспективной оценки дозы.

Теоретическое и практическое значение работы.

Проведенное динамическое наблюдение на протяжении длительного времени за частотами аберраций хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС, для которых были известны результаты цитогенетических исследований в ближайшие сроки после облучения, позволило изучить закономерности элиминации повреждений нестабильного типа и изменения уровней выявляемых с помощью классического метода атипичных хромосом, относящихся к аберрациям стабильного типа. Эти данные также дают возможность косвенно оценивать скорость пролиферации клеток, относящихся к лимфоидной ткани. На основе полученных результатов были построены уравнения множественной регрессии, включающие, во-первых, восстановленную компьютерным методом оценку дозы и, во-вторых, время, прошедшее после облучения, или частоту атипичных хромосом в отдалённые сроки, что позволяет осуществлять ретроспективную оценку дозы на основании классического цитогенетического анализа.

Положения, выносимые на защиту.

1. Для элиминации нестабильных аберраций хромосом в период от 5 до 20 лет после облучения на фоне высокой индивидуальной вариабельности характерно следование экспоненциальной модели со свободным коэффициентом. При этом частоты атипичных хромосом к концу периода наблюдения в среднем снизились до примерно 30%, 50% и 90% для пациентов, у которых первоначальные оценки дозы составляли 0,7-2,3 Гр, 2,8-4,3 Гр и 4,7-9,8 Гр соответственно.
   
2. Использование линейных уравнений множественной регрессии, включающих восстановленную компьютерным методом оценку дозы и время, прошедшее после облучения, или частоту атипичных хромосом в отдалённые сроки позволяет ретроспективно оценивать поглощённые дозы после осуществления классического цитогенетического анализа, по крайней мере, до 20 лет после облучения, хотя возрастание временного промежутка между моментами облучения и подсчёта аберраций хромосом приводит к увеличению ошибок измерения.
   
3. В сроки более 20 лет после облучения оценка дозы по уравнению, включающему восстановленную оценку дозы и частоту атипичных хромосом, обладает большей эффективностью, чем использование для этой цели уравнения, включающего восстановленную оценку дозы и время, прошедшее после радиационного инцидента.
   

Апробация диссертации состоялась на заседании секции № 4 Ученого совета ФГУ «Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна» ФМБА России 16 октября 2008 г. Основные положения работы были представлены на III международной конференции «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций» и семинаре «Перспективные проблемы космической радиобиологии применительно к длительным орбитальным и межпланетным пилотируемым полетам», г. Дубна 4-7 октября 2005 г.; на V съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность), г. Москва, 10-14 апреля 2006 г.; на международной научно-практической конференции «Чернобыльские чтения-2008», Беларусь, г. Гомель, 24-25 апреля 2008 г.; на 36-ом ежегодном съезде Европейского общества по радиационным исследованиям (European Radiation Research Society), Франция, г. Тур, 1-4 сентября 2008 г.

Внедрение результатов исследования.

По полученным данным написаны методические рекомендации «Возможности ретроспективной оценки дозы при использовании стандартного метода окраски хромосом» (утверждены зам. руководителя ФМБА России Л.Н. Бежиной 14 января 2008 г., рег. № 3-08). Результаты исследования внедрены в практику работы лаборатории радиационной гематологии и цитогенетики ФМБЦ им. А.И. Бурназяна.

Личный вклад автора.

Цитогенетические исследования материала, взятого у пациентов, поступавших в клинику Федерального медицинского биофизического центра им. А.И.Бурназяна ФМБА России (г. Москва), осуществлялись одновременно в лаборатории радиационной гематологии и цитогенетики (заведующий – доктор биол. наук В.Ю.Нугис) ФМБЦ им. А.И.Бурназяна и в лаборатории цитогенетики (заведующий – доктор биол. наук А.В.Севанькаев) РНЦ Института медицинской радиологии РАМН (г. Обнинск). При этом автор принимала личное участие в отборе пациентов, постановке культур лимфоцитов, приготовлении препаратов хромосом и подсчёте хромосомных аберраций. Статистическая обработка и анализ полученных результатов выполнены полностью ею.

Публикации.

Основные положения диссертации изложены в 8 публикациях: 4 статьях, 3 тезисах докладов, 1 методических рекомендациях.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Она включает 231 источник литературы (104 на русском и 127 на иностранных языках), изложена на 184 страницах и содержит 13 таблиц и 30 рисунков.


^ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Материалом для данного исследования послужила венозная кровь 47 пациентов, которые пострадали при различных радиационных авариях и были повторно госпитализированы в клинику через 2,2-51 год после облучения. В таблице 1 представлены некоторые общие сведения, характеризующие обследованный контингент. Отдельно выделены пациенты, пострадавшие при аварии на Чернобыльской АЭС и подвергшиеся смешанному гамма-бета-облучению. Следует особо отметить, что у данных пациентов в ближайшие сроки после радиационного воздействия была проведена цитогенетическая (по средней частоте дицентриков в культурах лимфоцитов периферической крови) оценка средних поглощенных доз. Также анализ полученных цитогенетических данных показал, что основная масса тела (за исключением кожи) подавляющего большинства чернобыльских пациентов подверглась относительно равномерному облучению.

^ Культивирование лимфоцитов периферической крови и приготовление препаратов хромосом были осуществлены или в соответствии с вариантом методики флуоресцент + Гимза (FPG) и последующим анализом аберраций хромосом только в клетках первого митоза независимо от времени культивирования (50-95 ч), или согласно модификации стандартного метода, рекомендуемого МАГАТЭ (IAEA, 2001) и инкубацией стимулированных фитогемагглютинином клеток, в течение 48 ч, что также приводило к исследованию в основном клеток первого митоза в культуре.

Таблица 1

Общие сведения об обследованных пациентах

Варианты аварий	Число аварий	Число обследованных пациентов	Диапазон исходных оценок средних доз на всё тело (Гр)	Диапазон времени обследования после облучения (года)	Общее число повторных взятий периферической крови
Чернобыльская АЭС	1	24	0,7-9,8	5,1-20,5	88
Гамма-нейтрон-ное облучение	5	6	0,8-4,1	17,3-51,1	15
Гамма-бета- облучение	5	13	0,6-3,7	27,1-48,7	29
Гамма-облучение	4	4	0,7-3,8	2,2-30,7	10
Всего	15	47	0,6-9,8	2,2-51,1	142

Цитогенетический анализ проводили под иммерсией при 1000-кратном увеличении. В зависимости от успешности роста культур при каждом обследовании было проанализировано от 60 до 1536 метафаз. Учитывали как аберрации хромосомного (парные фрагменты, дицентрики, центрические и ацентрические кольца, атипичные хромосомы), так и хроматидного (одиночные фрагменты, хроматидные обмены) типов. Для каждого дицентрика или центрического кольца сопутствующим считали один парный фрагмент.

^ Статистическая обработка результатов. Сравнение эмпирических распределений дицентриков и нестабильных аберраций по клеткам с теоретическим распределением Пуассона осуществляли по U-критерию Папворта. Этот критерий, в отличие от метода ², дает возможность выявить, является ли несоответствие какого-либо распределения пуассоновскому следствием более высокой или более низкой дисперсии. Кратко, данный критерий основан на равенстве средней и дисперсии в распределении Пуассона. Вычисляемая по специальной формуле величина "u" распределена по нормальному закону. Поэтому при -1,96  u  +1,96 распределение является пуассоновским с уровнем значимости большим/равным 5%. Положительные значения величины u демонстрируют повышенную (“сверхдисперсия”), а отрицательные  сниженную (“недодисперсия”) величину дисперсии по сравнению с ожидаемой при распределении Пуассона.

Регрессионный анализ данных осуществлялся с помощью компьютерной программы «Statistica 6.0». При этом, кроме линейной зависимости, в различных ситуациях при изучении закономерностей элиминации аберраций хромосом использовались следующие три основные модели экспоненциальной зависимости:

Y_T/Y₀ = aexp(bT), (I тип)

Y_T/Y₀ = с + exp(a + bT), (II тип)

Y_T/Y₀ = a₁exp(b₁T) + a₂exp(b₂T) (III тип),

где Y_Т – величина цитогенетического показателя через время Т (дни) после облучения, Y₀ – величина цитогенетического показателя немедленно после облучения, a, a₁, a₂, b, b₁, b₂, c – коэффициенты. Тип I можно обозначить как одиночную экспоненциальную зависимость, тип II – как одиночную экспоненциальную зависимость со свободной константой, а тип III – как двойную экспоненциальную зависимость.

^ Компьютерный метод ретроспективной оценки дозы. Компьютерное восстановление дозы в отдалённые сроки после облучения по результатам цитогенетического анализа культур лимфоцитов периферической крови осуществлялось с помощью программы, разработанной доктором биол. наук И.В.Филюшкиным. В качестве исходных данных использовались распределения клеток по числу содержащихся в них дицентриков или нестабильных аберраций. В основе данного подхода лежит факт отклонения распределений клеток по числу содержащихся в них дицентриков от теоретического распределения Пуассона в сторону «сверхдисперсии» и представление о симуляции неравномерности облучения при элиминации нестабильных аберраций хромосом с течением времени. Таким образом, в популяции первоначально облучённых в одной дозе клеток появляются как бы «необлучённые» неаберрантные клетки. Поэтому И.В.Филюшкин преобразовал первоначальную (многоканальную) версию своей компьютерной программы, предназначенную для оценки распределения доз по лимфоцитам при неравномерном радиационном воздействии, в новую (двуканальную: облучённая – необлучённая фракция клеток) версию, направленную на решение задачи ретроспективной оценки дозы.


Результаты исследований

^ 1. Изучение элиминации аберраций хромосом у лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС

Для математико-статистического описания закономерностей изменения величины различных цитогенетических показателей через 5-20 лет после аварии пациенты были разделены на 3 группы в зависимости от величины полученных доз, оцененных в ближайшие сроки после радиационного поражения: I группа – лица, облучённые в дозах от 0,7 до 2,3 Гр (8 человек, 33 повторные культуры с индивидуальной частотой взятия от 1 до 15); II группа – лица, облучённые в дозах от 2,8 до 4,3 Гр (12 человек, 36 повторных культур с индивидуальной частотой взятия от 1 до 9); III группа – лица, облучённые в дозах от 4,7 до 9,8 Гр (5 человек, 19 повторных культур с индивидуальной частотой взятия от 1 до 10). В качестве основной математической модели для описания изменения частот цитогенетических показателей была выбрана простая экспоненциальная зависимость со свободной константой (тип II).

На рис. 1 представлена динамика изменения через 5-20 лет после облучения отношений частот, наблюдаемых в отдалённые сроки, к первоначально зарегистрированным частотам для дицентриков, всех нестабильных аберраций (хромосомного типа), дицентриков на 1 клетку с дицентриками и Qdr соответственно. Как можно видеть, наблюдается значительная индивидуальная вариабельность при элиминации как дицентриков, так и нестабильных аберраций. Особенно это заметно на примере группы I, т.к. вследствие более низкого исходного уровня аберраций хромосом по сравнению с группами II и III относительное снижение в среднем оказывается меньше и диапазон колебаний лучше виден.

Очень высокая индивидуальная вариабельность обнаруживается и для частот дицентриков на 1 клетку с дицентриками и показателя Qdr, в целом более выраженная в последнем случае. При этом, несмотря на общую тенденцию к снижению величины обоих показателей в группах II и III в ряде случаев наблюдается превышение над исходными значениями. В связи с тем, что в группе I как частота дицентриков на 1 клетку с дицентриками, так и Qdr в среднем имеют наименьшие значения (для указанной частоты дицентриков у ряда пациентов она уже исходно равнялась 1, т.е. предельному минимальному значению), то в рассматриваемые сроки после воздействия радиации присущие им регрессионные кривые не только в целом располагались выше регрессионных кривых для групп II и III, но и практически не зависели от времени, прошедшего после облучения. Более того, для показателя Qdr в группе I наблюдалась даже некоторая, хотя и не достоверная, тенденция к увеличению его значений. Однако в целом, данный показатель, несмотря на мнение, высказываемое в рекомендациях МАГАТЭ (IAEA, 2001) не может использоваться для ретроспективной оценки дозы.

Изменение частоты атипичных хромосом (аномальных моноцентриков) также было изучено с помощью классической методики окраски хромосом, несмотря на то, что в этом случае идентифицируется лишь небольшая доля всех образующихся при облучении реципрокных транслокаций и инверсий. На рис. 2 представлена динамика отношений частот аномальных моноцентриков к исходным данным у пациентов, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС и разделённых на три дозовые группы за тот же срок после облучения. Обращает на себя внимание, что, начиная примерно с 10 лет после облучения, в







Рис. 1. Динамика отношений средних частот цитогенетических показателей в отдалённые сроки после облучения к их первоначальным частотам (по оси ординат) в течение 5-20 лет после облучения у лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС (по оси абсцисс – время, прошедшее после облучения, дни)



Рис. 2. Динамика отношений частот атипичных хромосом в отдалённые сроки после облучения к их первоначальным частотам в течение 6-20 лет после облучения у лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС.


группе I средние частоты атипичных хромосом выходят на уровень около 30%, в группе II – на уровень 53% и в группе III – на уровень 92% от их исходных средних частот у пациентов из указанных групп.

У одного из обследованных больных (исходная оценка дозы – 4,3 Гр) примерно через 20,7 лет после облучения был диагностирован хронический миелолейкоз (ХМЛ) с типичным его цитогенетическим маркером – Ph-хромосомой. К сожалению, последний за-забор периферической крови для постановки повторной культуры лимфоцитов был произведен более, чем за 7 лет 7 месяцев до развития клинических проявлений заболевания. В то же время среди атипичных хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови у различных чернобыльских пациентов из обследованной когорты довольно часто встречались аномальные моноцентрики, обычно обозначаемые как Ph-подобные. Однако никаких особых отличий по частотам этих перестроек у пациента, с развившимся в последствии ХМЛ, по сравнению с остальными пострадавшими в указанный период обследования не наблюдалось.

В связи с использованием разными авторами различных экспоненциальных моделей, было интересно проверить, какая из них более адекватно отражает общую тенденцию элиминации на притяжении всего периода наблюдений от двух месяцев до 20 лет после облучения. К сожалению, в связи с произошедшими политическими изменениями, количество пациентов, которые повторно госпитализировались спустя свыше 5 лет после облучения, сократилось до 24 человек, т.к. большая часть пострадавших из числа поступивших в клинику в острый период в настоящее время проживает на Украине. Чтобы избежать влияния на ход линий регрессии особенностей элиминации аберраций хромосом у отдельных людей, для указанной выше цели были использованы только те 24 пациента, которые ложились в клинику на обследование как в период до 5 лет, так и после этого срока. На рис. 3 представлены соответствующие линии экспоненциальной регрессии типов II и III, описывающие элиминацию дицентриков и нестабильных аберраций для II дозовой группы. Хотя коэффициенты корреляции для кривых типа II и III различались очень незначительно и равнялись соответственно 0,970 и 0,978 для дицентриков и 0,948 и 0,959 для нестабильных аберраций. Однако видно, что двойная экспоненциальная модель лучше соответствует эмпирическим точкам в наиболее отдалённые исследованные сроки. В двух остальных дозовых группах наблюдалась абсолютно тождественная картина.

Цитогенетические исследования, проведенные в сроки до 5 лет после чернобыльской аварии, продемонстрировали зависимость скорости падения уровней дицентриков и всех нестабильных аберраций от исходной полученной дозы: чем она была выше, тем выше была и скорость снижения частот хромосомных повреждений. Чтобы проверить, сохраняется ли данный эффект в более поздние сроки были выделены 6 пациентов, у которых частота повторных заборов крови была достаточно высокой (от 6 до 15). Для описания процесса некоторых цитогенетических показателей у каждого из этих пациентов в общем временном диапазоне от 5 до 20 лет после облучения была использована экспоненциальная модель I типа. Коэффициент b в этом уравнении фактически отражает темп процессов элиминации. Как оказалось, достоверная корреляция его величины с исходно оцененными дозами для частот дицентриков и всех нестабильных аберраций хромосомного типа на 100 клеток и процентов клеток с дицентриками и всеми нестабильными аберрациями отсутствовала. При этом время снижения величины цитогенетических показателей в 2 раза в настоящем исследовании в период от 5 до 20 лет после облучения составило для частоты дицентриков 1120 дней с 95%-доверительным интервалом от 798 до 1873 дней, для процента клеток с дицентриками 1364 дня с 95%-доверительным интервалом от 957 до 2382 дней, для частот всех нестабильных аберраций 1313 дней с 95%-доверительным интервалом от 1073 до 1691 дня и для клеток с нестабильными аберрациями хромосом 1593 дня с 95%-доверительным интервалом от 1189 до 2424 дней.






Рис. 3. Сравнение двух экспоненциальных моделей – II типа (одиночная экспонента со свободной константой – сплошная линия) и III типа (двойная экспонента – прерывистая линия), описывающих элиминацию дицентриков (верхний график) и всех нестабильных аберраций хромосомного типа (нижний график) в течение 20 лет после облучения во II дозовой группе пациентов, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС.

Первоначально в качестве вводного материала для компьютерной программы, предложенной И.В.Филюшкиным для восстановления полученных доз в отдалённые сроки после облучения, предлагалось использовать распределения клеток по числу содержащихся в них дицентриков. Как уже указывалось, идея заключалась в том, что элиминация аберраций приводит к имитации неравномерности радиационного воздействия, даже если исходно облучение носило равномерный характер. Это предполагало возникновение сверхдисперсности распределения аберраций. Однако с течением времени элиминация аберраций хромосом приводит к исчезновению или малой вероятности регистрации классов клеток с числом дицентриков больше 1. В этом случае ретроспективная оценка дозы автоматически будет производиться просто по средней частоте дицентриков и, естественно, окажется заниженной по сравнению с реальной полученной дозой. Поэтому было решено с той же целью использовать также распределения клеток по числу содержащихся в них нестабильных аберраций хромосомного типа, которые чаще содержат (после облучения) классы клеток с 2 и более повреждениями хромосом (дицентрики только один из видов нестабильных аберраций). Действительно, из 88 повторно взятых культур лимфоцитов через 5-20 лет после аварии на Чернобыльской АЭС сверхдисперсное распределение дицентриков наблюдалось в 44 случаях, а нестабильных аберраций – в 70 случаях. При этом, наличие клеток с числом дицентриков / нестабильных аберраций больше 1 явно реже встречалось при меньших дозах.

^ 2. Ретроспективная оценка дозы радиационного воздействия с помощью компьютерного метода у лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС

С помощью компьютерной программы было произведено восстановление дозы из распределений клеток по числу содержащихся в них дицентриков или нестабильных аберраций. Из полученных двух оценок (по дицентрикам и нестабильным аберрациям) для каждого случая была рассчитана средняя восстановленная оценка дозы. Для построения с помощью линейного регрессионного анализа единой зависимости первоначальной оценки дозы от её величины, восстановленной с помощью компьютерной программы, на протяжении всего 20-летнего пострадиационного периода наблюдений дальнейшие расчёты были произведены с привлечением данных, полученных ранее для сроков от 61 дня до примерно 5 лет после облучения (В.Ю.Нугис, 2003). На рис. 4 представлен соответствующий график, демонстрирующий, несмотря на сильную корреляцию (r = 0,829, p < 0,0001), заметное смещение восстановленных оценок в сторону меньших значений величин доз по сравнению с первоначальными результатами индикации дозы. Дальнейший регрессионный анализ показал, что, несмотря на значительную индивидуальную вариабельность, отношение восстановленной оценки дозы к её первоначально определённому значению статистически достоверно (со средней силой  r = 0,487, p < 0,00001) зависело от времени, прошедшего после облучения.

В связи с этим было принято решение получить уравнение множественной регрессии для установления зависимости первоначально определённого значения дозы от её восстановленного компьютерным методом значения и времени, прошедшего после облучения. На рис. 5 приведен график линейной связи между первоначально определённой величиной дозы и дозой, рассчитанной по этому уравнению, т.е. ретроспективной оценкой дозы. Можно видеть, что в среднем обе оценки не смещены относительно друг друга, т.к. график выходит из начала координат под углом 45.

Учитывая сохраняющиеся реальные различия уровней атипичных хромосом в выделенных дозовых группах в отдалённые периоды после облучения, была также получена зависимость первоначально оцененных значений дозы от её компьютерно восстановленных величин и наблюдаемых на моменты повторных обследований частот атипичных хромосом на 100 клеток. Это ещё один способ ретроспективной оценки дозы. График линейной зависимости первоначально полученных оценок дозы от ретроспективных оценок дозы, рассчитанных по этому второму уравнению, приведен на рис. 6. Как и в предыдущем варианте (рис. 5), оценки дозы в среднем не смещены относительно друг друга.

В таблице 2 представлены данные по проценту отклонений ретроспективных оценок дозы за пределы  25%-,  33%- и  50% от её исходно определённой величины в различные периоды времени после воздействия радиации. Как можно видеть, присоединение к общему массиву данных результатов всё более поздних исследований приводит к росту числа отклонений за обозначенные границы. Поэтому, применительно к использованию полученных зависимостей и в других возможных случаях отсроченного поступления пациентов, следует построить кривые зависимости для определённых периодов времени после облучения и использовать их в зависимости от сроков повторного исследования. Имеющийся материал в чисто техническом плане позволяет достаточно легко сделать это.

3. Изучение элиминации аберраций хромосом и ретроспективная оценка дозы у лиц, пострадавших при различных радиационных инцидентах, за исключением аварии на Чернобыльской АЭС

Подсчёт аберраций хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови в отдалённые сроки после облучения был также произведен у 23 пациентов, пострадавших в различных. У 2 пациентов кровь была взята (2 и 1 раз соответственно) в промежутке от 2

Рис. 4. Зависимость первоначальной цитогенетической оценки дозы от её восстановленного компьютерным методом значения в отдалённые сроки (до 20 лет) после облучения у лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС.


Рис. 5. Зависимость первоначальной цитогенетической оценки дозы (D₀, Гр) от её ретроспективной оценки, рассчитанной по уравнению множественной регрессии D₀ = (0,386  0,136) + (0,971  0,032) D_T + (0,000304  0,000036)Т (r=0,864, p < 0,0001), где D_T  восстановленная компьютерным методом оценка дозы (Гр), Т  время, прошедшее после облучения (дни).


Рис. 6. Зависимость первоначальной цитогенетической оценки дозы (D₀, Гр) от её ретроспективной оценки, рассчитанной по уравнению множественной регрессии, D₀ = (1,136  0,100) + (0,518  0,048) D_T + (0,145  0,014) А_m (r = 0,876, p < 0,0001), где D_T  восстановленная компьютерным методом оценка дозы (Гр), А_m  наблюдаемая на момент повторного обследования частота атипичных хромосом на 100 клеток.

Таблица 2

Процент отклонений ретроспективных оценок дозы от их исходно определённых

величин у лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС, в различные периоды времени после облучения при использовании для расчётов уравнений

множественной регрессии, включающих восстановленную дозу и время, прошедшее после облучения, (доза + время) или частоту атипичных хромосом (доза + маркер)

Вариант уравнения	Период времени после облучения	Число выполненных цитогенетических анализов	Процент (число) отклонений ретроспективных оценок на заданную величину от исходно определённой дозы
			 25%	 33%	 50%
Доза + время	До 6 лет	226	20,8% (47)	13,7% (31)	4% (9)
	До 12 лет	271	24,0% (65)	15,9% (43)	7,7% (21)
	До 20 лет	307	30,9% (95)	20,8% (64)	13,7% (42)
Доза + маркер	До 6 лет	226	17,7% (40)	10,2% (23)	2,7% (6)
	До 12 лет	271	18,8% (51)	13,7% (37)	7,0% (19)
	До 20 лет	307	34,9% (107)	23,5% (72)	9,8% (30)

лет 2 месяцев до 2 лет 8 месяцев после облучения. От всех остальных пострадавших материал был получен в общем временном диапазоне примерно от 17 лет 3 месяцев до 51 года 2 месяцев после воздействия радиации. В этой последней группе обнаруженные частоты дицентриков и нестабильных аберраций были очень малы и варьировали соответственно от 0 до 2,5 и от 0,2 до 6,5 на 100 клеток, а сверхдисперсное распределение дицентриков и нестабильных аберраций было обнаружено соответственно в 9 и 17 культурах из их общего числа, равного 51. Частоты атипичных хромосом колебались от 0 до 10,5 на 100 клеток.

Распределения клеток по числу содержащихся в них дицентриков и всех нестабильных аберраций, как и в случае с пострадавшими при аварии на Чернобыльской АЭС, были использованы для восстановления дозы с помощью компьютерной программы, разработанной доктором биол. наук И.В.Филюшкиным. Первоначальные оценки доз для каждого из пациентов этой группы были получены путём усреднения имевшихся значений доз, оцененных разными методами: физическим, цитогенетическим, гематологическим и по ЭПР-сигналу эмали зуба, а также выбора наиболее достоверных величин. Ретроспективные оценки доз были рассчитаны по 2 приведенным выше уравнениям множественной регрессии, полученным на материале чернобыльских пациентов.

На рис. 7 результаты ретроспективной оценки дозы, рассчитанные на основании исследования 3 культур лимфоцитов периферической крови, взятой от 2 пациентов в диапазоне 2 года 2 месяца –2 года 8 месяцев после облучения, наложены на зависимости первоначальных оценок дозы от её ретроспективных оценок, полученные на материале чернобыльском контингенте в сроки до 6 лет после аварии. У одного пациента ретроспективные оценки дозы на основании цитогенетического анализа 2 культур были настолько близки при использовании любого из двух уравнений, что на графиках они практически слились, причём находились в пределах 95%-доверительных интервалов для индивидуальных значений. Напротив, единственная ретроспективная оценка дозы, выполненная для другого пациента, существенно выходила за эти рамки, отклоняясь в сторону больших значений в обоих случаях. По-видимому, есть достаточно правдоподобное объяснение этому и связано оно с тем, что данный пострадавший подвергся резко неравномерному облучению с наличием существенного по объёму локального поражения в крайне высоких дозах. Так как использованная компьютерная программа основывается на уподоблении процесса элиминации появлению якобы необлучённых участков, т.е. «возникновению» неравномерности радиационного воздействия, то восстановленная оценка дозы отразила не столько среднюю дозу на всё тело, сколько дозу на наиболее поражённые регионы. Необходимо заметить, что данное отклонение для неравномерно облучённых пациентов, по-видимому, имеет значение только в относительно ранние сроки после облучения. Спустя большие сроки, скорее всего, реальные процессы элиминации уравнивают случаи равномерного и неравномерного воздействия радиации в отношении ретроспективной оценки дозы предлагаемым способом.

Аналогично, на рис. 8 метки, соответствующие индивидуальным результатам ретроспективных оценок доз, рассчитанных для пациентов, пострадавших в разных радиационных инцидентах, при их повторных цитогенетических обследованиях через примерно 17-51 год после облучения наложены на зависимости исходных оценок дозы от её ретроспективных оценок, полученные на материале чернобыльского контингента, но уже совокупно для сроков до 20 лет после аварии. Как видно, использование для ретроспективных оценок дозы у данного контингента уравнения множественной регрессии, включающего восстановленную оценку дозы и время, прошедшее после облучения в целом даёт неудовлетворительные результаты. Если точки, соответствующие культурам лимфоцитов, взятых в диапазоне 17-20 лет после облучения, по большей части лежат в пределах 95%-доверительных интервалов для индивидуальных значений, то в более поздние сроки наблюдается явный выход за эти пределы в сторону завышения ретроспективных оценок. Всё это обусловлено общим снижением уровня нестабильных аберраций хромосом, который в промежутке от 20 до 50 лет уже, по-видимому, меняется очень мало и, поэтому




Рис. 7. Расположение ретроспективных оценок доз для 2 пациентов (3 культуры лимфоцитов), обследованных через 2 года 2 месяца –2 года 8 месяцев после облучения на графиках зависимостей исходной величины дозы от её ретроспективной оценки, полученных на основании уравнений множественной регрессии для восстановленной с помощью компьютерной программы оценки дозы и времени (до 6 лет), прошедшего после облучения, (слева) или частоты атипичных хромосом (справа).




Рис. 8. Расположение ретроспективных оценок доз для пациентов, пострадавших при различных радиационных инцидентах, через 17-20 (закрашенные квадраты) и >20 (прозрачные квадраты) лет после облучения на графиках зависимостей исходной величины дозы от её ретроспективной оценки, полученных на основании уравнений множественной регрессии для восстановленной с помощью компьютерной программы оценки дозы и времени, прошедшего после облучения, (слева) или частоты атипичных хромосом (справа).

уравнение, полученное при анализе данных чернобыльских пациентов в сроки до 20 лет после облучения, уже не работает. По-другому обстоит дело при использовании уравнения множественной регрессии, включающего восстановленную оценку дозы и частоту атипичных хромосом в отдалённые сроки после облучения. Рис. 8 демонстрирует, что сделанные оценки дозы большей частью лежат в пределах 95%-доверительного интервала для индивидуальных значений.

^ 4. Частоты хроматидных аберраций в отдалённые сроки после облучения у лиц, пострадавших при различных радиационных ситуациях

Хотя по своей сути хроматидные фрагменты и обмены относятся к нестабильным аберрациям, однако наблюдение за изменениями их уровней – это не наблюдение за их элиминацией, а наблюдение за их индукцией в каждый отдельный момент времени при взятии образца крови. Здесь возникает активно обсуждаемая сейчас проблема пострадиационной хромосомной нестабильности, одним из показателей которой является частота хроматидных аберраций. На рис. 9 представлены их индивидуальные частоты в культурах лимфоцитов периферической крови в определённом текущем году после облучения и их средние значения ( стандартные ошибки среднего) у 24 пациентов, пострадавших при

Рис. 9. Частоты хроматидных аберраций у лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС, в отдалённые сроки после облучения (представлены как индивидуальные величины, так и их средние величины со стандартными ошибками среднего в каждый текущий год после данного радиационного инцидента).

аварии на Чернобыльской АЭС, которые были подвергнуты цитогенетическому обследованию в настоящей работе. Данные приведены за весь 20-летний период наблюдения, включая результаты первоначального анализа. Как можно видеть на рис. 9, исходно и в некоторые годы после облучения наблюдаются значительные индивидуальные колебания частот хроматидных аберраций. В отдельных случаях данный показатель явно выходит за границы своего спонтанного уровня. Соответственно наличию или отсутствию таких значений колеблется и средняя частота аберраций хроматидного типа, которая, как можно отметить, начиная с 13-ого года после облучения, перестаёт значительно варьировать и находится примерно на уровне 1 аберрации на 100 клеток и меньше. Могут ли полученные данные свидетельствовать о хромосомной нестабильности у чернобыльского контингента пациентов? По-видимому, нет, т.к., собственно говоря, отсутствует «массовость» выхода частот хроматидных аберраций за фоновые значения. Отдельные превышения этого уровня так и остаются индивидуальными событиями, по-видимому, не связанными с предыдущим облучением.

Учитывая участие ряда форменных элементов крови в защите организма от действия инфекционных агентов и известную связь между последними и индукцией хроматидных аберраций, была предпринята попытка оценить корреляцию между частотами хроматидных аберраций в культурах лимфоцитов периферической крови и числом всех лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов и процентом нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови. В этот анализ были включены все обследованные больные: как чернобыльские пациенты, так и лица, пострадавшие при других радиационных инцидентах. Статистически значимая корреляция между этими показателями отсутствовала.


ВЫВОДЫ

1. В течение всего отдаленного периода, от 2 до 50 лет, сохраняются цитогенетические маркеры имевшего место однократного внешнего облучения.
   
2. Элиминация нестабильных аберраций, включая дицентрики, обнаруживаемая при классической окраске хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС, в период от 6 до 20 лет после облучения, несмотря на большие индивидуальные различия, в среднем осуществляется в согласии с одноэкспоненциальной моделью со свободной константой. Для описания того же процесса за весь период наблюдения примерно от 2 месяцев до 20 лет после воздействия радиации необходимо использовать двуэкспоненциальую модель.
   
3. В период от 6 до 20 лет после аварии на Чернобыльской АЭС время, за которое частота аберраций хромосом уменьшается в 2 раза составляет: для частоты дицентриков  3 года, для процента клеток с дицентриками  3,7 лет, для частот всех нестабильных аберраций  3,6 лет, и для клеток с нестабильными аберрациями хромосом – 4,4 года.
   
4. Полученные на материале лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС, уравнения множественной регрессии, включающие, с одной стороны, восстановленные с помощью специальной компьютерной программы оценки доз и, с другой стороны, время, прошедшее после облучения, или частоты атипичных хромосом, регистрируемые в отдалённые сроки, позволяют производить ретроспективные дозовые оценки, по крайней мере, до 20 лет после воздействия радиации, хотя увеличение времени между моментом поражения и проведением цитогенетического анализа приводит к увеличению ошибок индивидуальных измерений.
   
5. Результаты повторных цитогенетических обследований пациентов, пострадавших при других, кроме чернобыльской аварии, радиационных авариях, демонстрируют возможность применения для ретроспективной оценки дозы в течение 20 и более лет после облучения уравнения множественной регрессии, включающего, помимо восстановленной с помощью компьютерной программы оценки дозы, частоту атипичных хромосом, но не время, прошедшее после радиационного воздействия.
   
6. При использовании классического метода окраски хромосом к концу 20-летнего периода цитогенетического наблюдения за лицами, пострадавшими при аварии на Чернобыльской АЭС, на фоне высокой индивидуальной вариабельности усредненное отношение суммарного выхода атипичных хромосом в повторно взятых культурах к их исходно определённым частотам составляло примерно 30%, 50% и 90% для пациентов, у которых первоначальные оценки дозы составляли 0,7-2,3 Гр, 2,8-4,3 Гр и 4,7-9,8 Гр соответственно.
   
7. Частота аберраций хроматидного типа в культурах лимфоцитов периферической крови у пострадавших пациентов в некоторые годы после облучения подвержена значительным индивидуальным колебаниям, но лишь в отдельных случаях с явным выходом за границы спонтанного уровня, что не свидетельствует о развитии феномена хромосомной нестабильности. Связь между уровнями хроматидных аберраций и количеством / процентом лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови отсутствует.
   

^ Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Нугис В.Ю., Дудочкина Н.Е. Компьютерный способ использования нестабильных аберраций для ретроспективной оценки дозы после острого облучения // III Международной конференции «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций» и семинар «Перспективные проблемы космической радиобиологии применительно к длительным орбитальным и межпланетным пилотируемым полётам», Дубна, 4-7 октября 2005 г. Тезисы докладов.  М. Издательство Российского университета дружбы народов, 2005.  С. 85-86.
   
2. Нугис В.Ю., Дудочкина Н.Е. Закономерности элиминации аберраций хромосом у людей после острого облучения по данным культивирования лимфоцитов периферической крови в отдаленные сроки // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2006. – Т. 46, № 1. – С. 5-15.
   
3. Нугис В.Ю., Дудочкина Н.Е. Ретроспективная оценка дозы с помощью компьютерного анализа распределений клеток по числу аберраций // V съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность), Москва 10-14 апреля 2006 г. Тезисы докладов.  М., 2006.  Т. 1.  С. 64.
   
4. Нугис В.Ю., Дудочкина Н.Е. Цитогенетические показатели в отдаленные сроки после острого облучения людей. Компьютерный метод ретроспективной оценки дозы // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2007. – Т. 47, № 1. – С. 74-79.
   
5. Нугис В.Ю., Дудочкина Н.Е. Возможности ретроспективной оценки дозы при использовании стандартного метода окраски хромосом // ФМБА России, методические рекомендации, 2007, рег № 3-08. – 15 с.
   
6. Нугис В.Ю., Севанькаев А.В., Хвостунов И.К., ^ Дудочкина Н.Е., Голуб Е.В., Надежина Н.М., Галстян И.А. Длительное наблюдение за элиминацией аберраций хромосом в культурах лимфоцитов у лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС: ретроспективная оценка дозы // Чернобыльские чтения-2008. Материалы международной научно-практической конференции, Гомель, 24-25 апреля 2008 г.  Гомель: “Сож”, 2008.  С. 190-196.
   
7. Sevan’kaev A.V., Khvostunov I.K., Lloyd D.C., Voisin Ph., Shepel N.N., Galstian I.A., Dudochkina N.E., Nadejina N.M., Nugis V.Yu. The chromosomal aberration assay for biological dosimetry a long time after exposure // Чернобыльские чтения-2008. Материалы международной научно-практической конференции, Гомель, 24-25 апреля 2008 г.  Гомель: “Сож”, 2008.  С. 248-253.
   
8. Nugis V.Yu., Sevan’kaev A.V., Khvostunov I.K., Dudochkina N.E., Golub E.V., Nadejina N.M., Galstyan I.A. The continuous observation by chromosome aberration elimination at irradiated persons // Radioprotection.  2008.  V. 43, № 5.  P. 46.