Химико-токсикологический анализ некоторых производных фенилалкиламина (кетамина, мидокалма, флуоксетина, сиднокарба) 14. 04. 02. Фармацевтическая химия, фармакогнозия
| Вид материала | Автореферат диссертации |
- Синтез соединений на основе химических превращений производных α- оксокарбоновых кислот, 643.93kb.
- План лекций по дисциплине «Токсикологическая химия» для студентов, 29.5kb.
- Синтез и свойства новых производных 2 (1,2,4 триазолил 5 тио)уксусных кислот 15. 00., 240.9kb.
- План лекций по дисциплине «Токсикологическая химия» для студентов IV курса специальности, 22.69kb.
- Синтез, свойства и биологическая активность енаминоамидов ацилпировиноградных кислот, 439.81kb.
- Химико-фармакологическое исследование специфических органических веществ торфа 15., 326.68kb.
- Примерная программа рекомендуется для направления подготовки (специальности) 111801, 717.4kb.
- Синтез, свойства, биологическая активность n-гетериламидов α-оксокислот и продуктов, 367.21kb.
- Программа курса «Аналитическая химия» специальность «Фармация», 92.69kb.
- Тематический план лекций по дисциплине «Фармацевтическая химия», 32.57kb.
На правах рукописи
КАЗАРЦЕВ ИЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВИЧ
ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНИЛАЛКИЛАМИНА
(кетамина, мидокалма, флуоксетина, сиднокарба)
14.04.02. Фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
ПЕРМЬ – 2011
Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
| Научный руководитель: | доктор фармацевтических наук, профессор Федосеева Людмила Михайловна |
| Официальные оппоненты: | доктор фармацевтических наук, профессор Ярыгина Татьяна Ивановна ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России |
| | доктор фармацевтических наук, профессор Куклин Владимир Николаевич ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России |
| Ведущая организация: | ГБОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России |
Защита состоится 17 января 2012 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, д.2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: г. Пермь, ул. Крупской, д.46.
Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации w.mon.gov.ru
«___» декабря 2011 г. и на сайте ПГФА ссылка скрыта «__» декабря 2011 г.
Автореферат разослан «___» декабря 2011 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д 208. 068. 01,
кандидат фармацевтических наук,
доцент И.А. Липатникова
Введение
Актуальность темы. Среди большого арсенала лекарственных веществ, действующих преимущественно на центральную нервную систему, широко используются производные фенилалкиламина. Интерес вызывают сиднокарб, флуоксетин, мидокалм и кетамин.
Сиднокарб - стимулятор центральной нервной системы, широко исполь-зуется в психиатрической практике. Относится к допинговым препаратам, запрещен для применения в спортивной медицине.
Мидокалм - спазмолитическое средство центрального действия. Отмечены случаи использования мидокалма больными наркоманией для снятия спазмов гладкой мускулатуры при абстинентном синдроме. Передозировка мидокалма вызывает состояние легкого опьянения, описаны смертельные отравления. (Кобзарь Я.В., 1989 г.).
Кетамин относится к группе неингаляционных средств для наркоза. Применение в малых дозировках вызывает диссоциативное действие на психику человека подобно некоторым наркотическим средствам (фенциклидин).
Флуоксетин - антидепрессант третьего поколения, используется для лечения депрессивных расстройств и шизофрении, чаще всего в сочетании с коаксилом, амитриптилином, грандаксином. Зафиксированы отравления флуоксетином (Wong D.T., 2005 г.).
Резкое увеличение незаконного оборота наркотических веществ в последние годы вызвало активное использование кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба больными наркоманией для усиления состояния наркотического опьянения и облегчения проявлений абстинентного синдрома.
По данным Алтайского краевого Бюро судебно-медицинской экспертизы за последние пять лет на территории края было зарегистрировано несколько случаев смертельного отравления кетамином, в том числе и в сочетании с производными барбитуровой кислоты. Отмечены случаи обнаружения мидокалма, сиднокарба и флуоксетина в моче в ходе наркологического мониторинга.
Применение кетамина, мидокалма. сиднокарба и флуоксетина в медицинской практике, токсическое действие и случаи передозировок определяют их важное токсикологическое значение. Однако, в доступной литературе не обнаружено методик химико-токсикологического анализа данных препаратов. Использование общепринятых методов изолирования (Васильевой А.А., Стаса-Отто, Карташова В.А.) приводит к низким выходам определяемых веществ (Карташов В.А., 2002 г.).
Разработанные методики идентификации и количественного анализа исследуемых производных фенилалкилмина различными физико-химическими методами не адаптированы к условиям практического химико-токсикологического анализа.
Не разработаны методики обнаружения кетамина, сиднокарба. флуоксетина и мидокалма при совместном присутствии с другими лекарственными препаратами (димедролом, производными фенотиазина и т.п.), нет данных о сохраняемости изучаемых веществ при гнилостном разложении биологического материала.
Анализ литературных данных и результатов практических экспертиз выявил необходимость разработки методик химико-токсикологического анализа кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба.
Цель исследования Разработка методик химико-токсикологического анализа мидокалма, кетамина, сиднокарба и флуоксетина в биологических жидкостях и тканях внутренних органов.
Задачи исследования:
- Определить оптимальные значения факторов экстрагирования кетамина, сиднокарба, мидокалма и флуоксетина.
- Разработать методики изолирования мидокалма, сиднокарба, флуоксетина и кетамина из биологических жидкостей (кровь, моча) и тканей внутренних органов.
- Подобрать оптимальные условия очистки методом ТСХ.
- Изучить спектральные характеристики исследуемых веществ методами прямой и дифференциальной спектрофотометрии в УФ области.
- Разработать индивидуальные и скрининговые методики идентификации мидокалма, сиднокарба, флуоксетина и кетамина методом ТСХ.
- Определить условия разделения кетамина, сиднокарба, флуоксетина и мидокалма методом ГЖХ с использованием насадочных и капиллярной колонок для идентификации и количественного анализа.
- Модифицировать методики идентификации и количественного анализа кетамина, сиднокарба, флуоксетина и мидокалма методом изократической и градиентной ВЭЖХ.
- Разработать схему анализа трупного материала в случаях комбинированных отравлений изучаемыми веществами в сочетании с димедролом, дипразином, амитриптилином, тиопенталом-натрием.
- Изучить сохраняемость кетамина, сиднокарба, флуоксетина и мидокалма в трупном материале.
Научная новизна работы. Определены условия экстракции кетамина, сиднокарба, флуоксетина и мидокалма из биологических жидкостей и тканей внутренних органов. Разработаны методики изолирования, обеспечивающие более высокие значения выходов исследуемых веществ по сравнению с общепринятыми методами (Васильева А.А., Карташов В.А.).
Установлены оптимальные условия разделения, способы детектирования и количественного определения кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба в извлечениях из биологического материала различными физико-химическими методами анализа: тонкослойная, газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография, спектрофотометрия в УФ области.
Показана возможность использования разработанной методики химико-токсикологического анализа для исследования случаев комбинированных отравлений изучаемыми веществами в сочетании с димедролом, дипразином, амитриптилином, тиопенталом-натрием.
Изучена сохраняемость мидокалма, флуоксетина, сиднокарба и кетамина при гнилостном разложении трупного материала.
Практическая значимость работы. Предложены методики идентификации и количественного определения мидокалма, кетамина, сиднокарба и флуоксетина в извлечениях из крови, мочи и тканей внутренних органов с применением различных физико-химических методов анализа (ТСХ, ВЭЖХ, ГЖХ, СФМ-УФ), которые могут применяться в судебно-химических лабораториях с целью диагностики отравлений и в учебном процессе студентов, обучающихся по специальности «Фармация» при освоении дисциплины «Токсикологическая химия».
Степень внедрения. На основании проведенных исследований разработаны методические рекомендации, основные положения которых апробированы в судебно-химических лабораториях Алтайского краевого Бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 28.05.2007 г.), Новосибирского областного Бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 13.07.2007 г.), Санкт-Петербургского городского Бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 29.08.2007 г.).
Разработан проект информационного письма «Об определении мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба в трупном материале».
Теоретические положения и результаты экспериментальных исследований используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе кафедры фармацевтической химии с курсом органической и токсикологической химии ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет Росздрава» и кафедры токсикологической химии ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава».
Основные положения, выносимые на защиту. Результаты разработки методик химико-токсикологического анализа кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба в биологических жидкостях и тканях внутренних органов.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы обсуждены на научно-практических конференциях «Молодежь Барнаулу» (Барнаул, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007 гг.), «Актуальные проблемы судебной медицины и экспертной практики» (Барнаул, 2004, 2005, 2006, 2007 гг.), «Наука о человеке» (Томск, 2005 г), «Аналитические методы и приборы для химического анализа» (Санкт-Петербург, 2007 г), на региональной научно-практической конференции (с международным участием) «Состояние, перспективы судебно-токсикологической службы и научных исследований» (Харьков, 2005 г.), российской научно-практической конференции (с международным участием) «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (Пермь, 2009 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом основных научных исследований ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет Росздрава» (номер государственной регистрации 01200600351).
Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации, заключается в том, что он является инициатором, основным исполнителем исследований и автором написания публикаций по теме диссертации. При выполнении работы автор освоил и самостоятельно выполнил все используемые методики исследования, математический анализ и статистическую обработку данных.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, две из которых в журналах, рекомендуемых ВАК.
Экспериментальное исследование по теме диссертации выполнялось на базе Алтайского государственного медицинского университета на кафедре фармацевтической химии с курсом органической и токсикологической химии и Алтайского краевого Бюро судебно-медицинской экспертизы.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 171 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, собственных исследований (3 главы), выводов, списка литературы, включающего 152 источника, из них 51- на иностранных языках, приложений. Работа иллюстрирована 55 таблицами и 37 рисунками.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследований, показана новизна и практическая значимость проведенных исследований, основные положения, выносимые на защиту.
Первая глава содержит обзор отечественной и зарубежной литературы, отражает современное состояние исследований в области фармакологии, токсикологии, химико-токсикологического анализа некоторых производных фенилалкиламина (кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба).
Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследования.
В третьей главе приведены результаты изучения факторов экстрагирования исследуемых препаратов и разработки методик изолирования исследуемых веществ из биологических жидкостей (крови, мочи) и тканей внутренних органов. Оптимизированы условия очистки полученных извлечений методом ТСХ, позволяющие свести к минимуму потери выделяемых веществ.
В четвертой главе изложены результаты исследования спектральных характеристик кетамина, мидокалма, сиднокарба, флуоксетина. Определены хроматографический характеристики и выбраны оптимальные условия разделения, идентификации и количественного анализа методами ГЖХ и ВЭЖХ. Модифицированы методики индивидуальной и скрининговой идентификации методом ТСХ. Проведена валидация разработанной методики химико-токсикологического анализа.
В пятой главе показана возможность применения разработанной методики химико-токсикологического анализа кетамина, мидокалма, сиднокарба, флуоксетина для решения различных научных и практических задач. Доказана эффективность использования разработанной методики исследования внутренних органов лабораторных животных (крыс) после однократного и многократного введения изучаемых препаратов и проведения анализа для экспертных случаев. Разработана схема исследования случаев комбинированных отравлений изучаемыми веществами в сочетании с димедролом, дипразином, амитриптилином и тиопенталом натрием. Изучена сохраняемость кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба при гнилостном разложении трупного материала.
В приложениях представлены данные спектральных и хроматографических характеристик кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба, результаты квантово-химических исследований молекул, проект информационного письма, документы, подтверждающие внедрение результатов диссертационной работы.
Объекты и методы исследования.
В качестве объектов исследования использовали растворы РСО: кетамина гидрохлорида, мидокалма (толиперазона гидрохлорида), флуоксетина гидрохлорида и сиднокарба, «модельные смеси», внутренние органы лабораторных животных (крыс) и экспертный материал.
Определение оптимальных условий изолирования проводили с использованием «модельных смесей»: измельченные ткани печени, цельную кровь или мочу трупов с определенным количеством добавленного исследуемого вещества (Карташов В.А., 1989).
Контрольные опыты проводили для каждой серии экспериментов с применением «модельных смесей» без добавления исследуемых веществ.
Идентификацию и количественное определение кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба в извлечениях из биологического материала осуществляли физико-химическими методами исследования: ТСХ, ВЭЖХ («Милихром А-02»), ГЖХ («Кристалл-2000» с ДИП), СФМ-УФ («Specord-40M»).
Апробацию разработанной методики химико-токсикологического анализа кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба проводили с использованием экспертного материала и крыс обоего пола массой 150-200 г, при однократном и многократном введении исследуемых препаратов.
Схему химико-токсикологического исследования случаев комбинированных отравлений изучаемыми веществами в сочетании с димедролом, дипразином, амитриптилином и тиопенталом-натрием разработали с использованием «модельных смесей», экспертного материала.
Изучение сохраняемости кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба в трупном материале проводили с использованием «модельных смесей».
Для квантово-химических расчетов показателей энергии низшей свободной молекулярной орбитали (НСМО), коэффициента распределения в системе октанол-вода (logP), моделирования геометрии и 3D структуры изучаемых препаратов применили компьютерную программу HyperChem Pro 6.0 (метод АМ-1), для определения показателя константы кислотности (рКа) -ACD/pKa v4.03.
Разработка методик изолирования и очистки кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба.
Для разработки методик изолирования кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба необходимо установить основные факторы, определяющие выход токсического вещества при экстрагировании из биологического материала: природа растворителя и значение рН среды.
Приближенный теоретический расчет значений указанных факторов для изучаемых препаратов провели с использованием показателей: энергия НСМО, коэффициент распределения в системе октанол-вода, показатель константы кислотности. По общепринятым методикам экспериментально установили оптимальные значения факторов экстрагирования в системе: органический растворитель-вода (табл. 1).
Таблица 1
Результаты определения оптимальных значений факторов экстрагирования исследуемых производных фенилалкиламина
| Вещество | Факторы экстрагирования | |||
| Экстрагент (степень экстракции, %) | Значение рН | |||
| Расчетный | Эксперимент | Расчетный | Эксперимент | |
| Флуоксетин | Экстрагенты с НСМО>0 и низким значением LogP (эфир диэтиловый) | Углерод четыреххлористый (64%) | 8,5-10,5 | 8,0-10,0 |
| Сиднокарб | Эфир диэтиловый (33%) Углерод четыреххлористый (36%) | Не опр. | 3,0-3,5; 8,0-8,5 | |
| Мидокалм | Экстрагенты с НСМО<0 и низким значением LogP (хлороформ, бензол, углерод четыреххлористый) | Хлороформ (95%) Углерод четыреххлористый (87%) | 9,0-11,0 | 9,0-10,0 |
| Кетамин | Хлороформ (97%) Бензол (93%) | 6,5-8,5 | 8,5-9,5 | |
Оптимальные условия экстракции мидокалма из водной среды: рН=9,0 -10,0; экстрагенты- хлороформ, углерод четыреххлористый (степень экстракции составила 95% и 87%), кетамина: рН= 8,5 - 9,5, экстрагенты- хлороформ, бензол (97% и 93%), флуоксетина: рН=8,0 - 10,0, экстрагент - углерод четырех-хлористый (64%).
Сиднокарб имеет два интервала оптимальных значений рН экстрагирования: 3,0 - 4,0 и 8,0 - 10,0, что можно объяснить наличием двух таутомерных форм сиднониминового цикла, устойчивого в кислой среде и раскрывающегося при увеличении значения рН. Максимально сиднокарб экстрагируется из водной среды при рН=3,0; экстрагент - эфир диэтиловый (степень экстракции 33% ), при рН=8,0; углерод четыреххлористый - 36%.
На основании установленных оптимальных значений факторов экстрагирования разработали методику изолирования из мочи (рис. 1).
Далее используя аликвоты мочи трупа с внесенными определенными количествами исследуемых веществ («модельные смеси»), установили выходы кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба (табл. 2).
Установлено, что разработанная методика изолирования из мочи обеспечивает высокие значения выхода мидокалма (94%), кетамина (95%) и флуоксетина (55%).
Биологическая жидкость (моча, кровь)
Разрушение комплексов белок- исследуемое вещество при добавлении ацетонитрила
Для крови
Очистка от липидов и порфиринов
(экстракция гексаном)
Очистка от примесей кислотного характера
(экстракция эфиром диэтиловым)
рН=2,0 (НCI, 10%)
Извлечение флуоксетина и сиднокарба
(двухкратная экстракция углеродом четыреххлористым)
рН= 8,5 (натрия карбонат)
рН=10,0 (NH4OH, 25%) Извлечение мидокалма, кетамина, сиднокарба
(последовательная экстракция хлороформом и
эфиром диэтиловым)
натрия хлорид
Рис.1 Схема изолирования исследуемых веществ из биологических жидкостей
Выход сиднокарба при использовании данной методики неудовлетворителен (менее 30%), поэтому разработана частная методика изолирования сиднокарба.
Таблица 2
Результаты определения степени изолирования исследуемых веществ из крови и мочи
-
Вещество
Степень изолирования, % (n=5; P=95%; tp=2,78)
Кровь
Моча
Хср Х
SХср
Е, %
Хср Х
SХср
Е, %
Мидокалм
79,823,27
1,6664
2,11
93,753,51
1,6153
1,67
Кетамин
71,683,09
1,3826
1,93
95,242,31
1,0312
1,08
Флуоксетин
38,123,55
1,5889
4,17
55,002,78
1,2433
2,26
Сиднокарб
19,501,26
1,3619
2,68
23,771,90
0,8478
3,57
Степень изолирования сиднокарба при использовании частной методики составила 44,36%2,51% (SХср =1,0412; Ε=2,51%).
Для исследования крови дополнительно провели разрушение комплексов белок - определяемое вещество с последующей очисткой гексаном. В качестве методов разрушения указанных комплексов применили добавление амфифильного растворителя (ацетонитрила), денатурирующего агента (кислоты трихлоруксусной) и кислотный гидролиз.
Установлено, что оптимальным методом разрушения комплексов исследуемые вещества - белки плазмы крови является добавление амфифильного растворителя - ацетонитрила (табл. 2). Применение денатурирующих агентов и гидролиз приводит к полной потере изолируемого вещества (более 85%).
Максимальный выход исследуемых производных фенилалкиламина из тканей внутренних органов обеспечивается применением оптимальных экстрагентов, кратности экстракции и рН среды экстрагирования, которые установили по методике Карташова В.А.
В качестве экстрагентов исследовали органические растворители различной природы (гидрофильные, липофильные и гидрофобные): раствор кислоты щавелевой 0,1%, раствор кислоты хлороводородной 0,1 н.; гексан, хлороформ, эфир диэтиловый; спирт этиловый 96%, ацетон, ацетонитрил и смесь ацетон-спирт этиловый 96% (1:1).
Установлено, что максимальная степень изолирования мидокалма из биологического материала достигается при использовании трехкратной экстракции ацетонитрилом - 87%, ацетоном - 52%; кетамина - 58% и 56%; флуоксетина - 42% и 39%; сиднокарба - 29% и 18%.
Далее выбрали оптимальные значения рН среды. Для создания необходимых рН применили растворы кислоты хлороводородной (рН=2,0) и аммония гидроксида (рН=10,0). На первой ступени экстракции использовали ацетонитрил, а на последующих – ацетонитрил, к которому в равном количестве добавляли воду очищенную (рН=7,0), раствор кислоты хлороводородной 0,1 н. (рН=2,0), раствор аммония гидроксида 5% (рН=10,0).
Установлено, что максимальный выход исследуемых веществ наблюдается при использовании экстрагента с рН=7,0: мидокалм - 71%, кетамин - 50%, флуоксетин - 41%, сиднокарб - 25%.
На основании установленных оптимальных значений факторов экстрагирования разработали методику изолирования кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба из тканей внутренних органов (рис. 2).
Внутренние органы (печень)
Экстракция ацетонитрилом (рН=7,0)
Двухкратная экстракция смесью ацетонитрил- вода очищенная (1:1) (рН=7,0)
Очистка от липидов (экстракция гексаном)
+ НCI, 10% (рН=2,0)
Экстракция эфиром диэтиловым
Водная фаза
Кислое извлечение
рН= 8,0, глициновый буфер (сиднокарб)
рН=8,5, натрия карбонат (флуоксетин)
Экстракция углеродом четыреххлористым
Щелочное извлечение
рН=10,0 (NH4OH, 25%), NаCI Последовательная экстракция хлороформом и
эфиром диэтиловым
глициновый буфер (сиднокарб)
Рис.2. Схема изолирования исследуемых веществ из тканей внутренних органов
Общий выход кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба из тканей внутренних органов определили с использованием «модельных смесей»: навеска печени трупа с добавлением определенных количеств веществ (табл. 3).
В качестве сравнения использовали общепринятые методики изолирования Васильевой А.А., Карташова В.А.
Установлено, что разработанная методика изолирования из тканей внутренних органов обеспечивает более высокий выход мидокалма (85%), кетамина (60%), флуоксетина (35%), сиднокарба (38%), чем по методу Васильевой А.А.: мидокалм - 29%, кетамин - 12%, сиднокарб - 12%, флуоксетин- менее 5%; по методу Карташова В.А.: мидокалм - 41%, кетамин - 26%, флуоксетин - 21%, сиднокарб - 37%.
Таблица 3
Результаты определения степеней изолирования исследуемых веществ из тканей внутренних органов (без проведения очистки)
-
Препарат
Степень изолирования, % (n=5; P=95%; tp=2,78)
Кислое извлечение
Щелочное извлечение
Хср Х
SХср
Е, %
Хср Х
SХср
Е, %
Мидокалм
15,901,69
0,7563
4,76
69,443,42
1,5293
2,20
Кетамин
Менее 5%
-
-
59,203,12
1,3955
2,36
Флуоксетин
10,562,31
1,0312
6,77
24,962,90
1,2968
5,02
Сиднокарб
18,062,10
0,9405
5,21
22,632,25
1,0065
3,45
Для очистки полученных извлечений применили метод ТСХ на пластинках «Sorbfil», элюент- спирт этиловый 96%. Установлено, что потери исследуемых препаратов в ходе очистки не превышают 30%.
Таким образом, в ходе проведенных исследований разработаны методики изолирования и очистки мидокалма. кетамина, флуоксетина и сиднокарба из биологических жидкостей и тканей внутренних органов.
Оптимизация условий идентификации и количественного определения исследуемых веществ в извлечениях из биологических объектов.
Для идентификации производных фенилалкиламина в извлечениях из био. объектов использовали: ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ, спектрофотометрия в УФ - области.
Определены условия оптимального разделения мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба методом ТСХ. Системы растворителей: спирт н-бутиловый, хлороформ - ацетон (7:3) и спирт н-бутиловый – эфир диэтиловый (8:2). Реактивы для проявления хроматограмм: реактивы Драгендорфа, Бушарда, раствор нингидрина в спирте н-бутиловом 1%, раствор калия йодплатината 5%, раствор натрия нитропруссида 5%.
Для идентификации методом СФМ-УФ рассчитаны и экспериментально изучены спектральные характеристики кетамина, сиднокарба, флуоксетина и мидокалма в УФ-области.
Выявлена зависимость спектральной характеристики сиднокарба от значения рН среды: при рН=10,0 максимумы поглощения оптической плотности смещаются до 253 и 334 нм. Поэтому для исследования сиднокарба применили метод дифференциальной спектрофотометрии.
Установлены сольватохромные эффекты мидокалма и флуоксетина, которые являются их дополнительным идентифицирующим признаком. Для мидокалма максимум поглощения при изменении полярности среды от раствора кислоты хлористоводородной 0,1 н. до спирта этилового или ацетонитрила смещается от 264 до 257-258 нм (батохромный эффект), отношение оптической плотности максимума спектра в указанных средах менее единицы (0,6-0,8 гипохромный эффект); для флуоксетина - отношение оптической плотности максимума спектра более единицы (1,1-1,7 гиперхромный эффект), положение максимума поглощения при этом не изменяется.
Для качественного анализа методом ГЖХ использовали капиллярную кварцевую колонку (25 м, 0,25 мм) с привитой фазой SE-30 и насадочные стальные колонки (2 м *4 мм) с сорбентами: 5% Apieson-L на Chromaton N-AW-NMDC 0,1-0,125; 5% XE-60 на Chromaton N-AW-NMDC 0,1-0,125; 3% SE-30 на Chromaton N-Super 0,16-0,20; 5% OV-225 на Inerton-Super 0,125-0,16; 5% Carbovax-20M на Chromaton N-AW-DMCS 0,125-0,16, изготовленные по общепринятым методикам. Идентификацию проводили по абсолютному и относительному времени удерживания исследуемых веществ (внутренний стандарт- фенацетин).
Установлено, что максимальное разделение пиков исследуемых веществ и внутреннего стандарта достигается при условиях хроматографирования- насадочные колонки НЖФ 5% Apieson-L и 5% XE-60, режим программирования: температура колонки от 150 до 220С, газ-носитель (азот) - 30 мл/мин; капиллярная колонка - режим программирования температуры колонки от 170 до 210С, газ-носитель (азот) - 1,0мл/мин, деление потока 1:100.
Для ВЭЖХ использовали обращено-фазную хроматографию в изократическом и градиентном режимах на колонке “Prontosil-120-5-C18” (75 мм/2мм). В качестве подвижной фазы применяли элюенты А на основе раствора кислоты трифторуксусной, лития перхлората, калия гидрофосфата, калия дигидрофосфата и элюенты Б на основе ацетонитрила и смеси ацетонитрил- спирт метиловый.
Идентификацию проводили по показателям объема удерживания (абсолютный и относительный), спектральным отношениям и спектральным углам (внутренний стандарт - новокаин). Для дополнительной идентификации использовали базу данных «БД-2003-350».
Выявлено, что максимальное разделение мидокалма, кетамина, флуоксетина, сиднокарба и внутреннего стандарта (новокаина) происходит при применении следующих условий хроматографирования: изократический режим- раствор лития перхлората 0,2М в водном растворе кислоты хлорной 0,05М – ацетонитрил - спирт метиловый (10:7:3). Градиентный режим - элюент А: раствор кислоты трифторуксусной водный 0,1%., элюент Б: ацетонитрил - спирт метиловый(5: 5).
Определен предел обнаружения исследуемых веществ по разработанной нами методике химико-токсикологического анализа.
Установлено, что предел обнаружения для идентификации мидокалма и кетамина на 100 г исследуемого объекта при использовании наиболее чувствительных методов (ВЭЖХ и ТСХ) составляет: в моче 30 мкг, а в печени- 50 мкг, для флуоксетина и сиднокарба в моче 50 мкг, в печени 100 мкг.
Количественное определение исследуемых веществ в извлечениях из биологических объектов проводили методом ГЖХ, ВЭЖХ и спектрофотометрии в УФ области спектра.
Предел количественного определения на 100 г исследуемого объекта мидокалма и кетамина в моче составляет 50 мкг, в печени- 100 мкг; флуоксетина и сиднокарба: в моче 50 мкг, в печени- 150 мкг. При использовании метода ВЭЖХ максимальная погрешность составила от 5 до 9%, СФМ - от 5 до 8%, ГЖХ- от 6 до 9% (табл. 5).
Использование метода СФМ для количественного определения флуоксетина нецелесообразно в связи с достаточно высокой погрешности определения – более 20%, поскольку максимум оптической плотности находится в области 210-230 нм, идет поглощение компонентов биологической матрицы.
Таблица 4
Результаты расчета предела количественного содержания исследуемых веществ (мкг препарата на 100 г объекта).
| Препарат | СФМ | ГЖХ | ВЭЖХ | | |||||||||||
Хср Х | SХср | Е, % | Хср Х | SХср | Е, % | Хср Х | SХср | Е, % | | ||||||
| | Биологические жидкости (моча) | | |||||||||||||
| Мидокалм | 50,135,76 | 5,0010 | 11,48 | 97,565,16 | 4,4859 | 5,28 | 48,464,55 | 3,9609 | 9,39 | ||||||
| Кетамин | - | - | - | 99,127,51 | 6,5402 | 7,58 | 51,433,90 | 3,3967 | 7,59 | ||||||
| Сиднокарб | 150,829,64 | 8,3926 | 6,39 | - | - | - | 52,545,64 | 4,9140 | 9,76 | ||||||
| Флуоксетин | 156,6631,66 | 27,5534 | 20,21 | - | - | - | 54,365,88 | 5,1184 | 10,22 | ||||||
| | Внутренние органы (печень) | | |||||||||||||
| Мидокалм | 100,918,18 | 7,1145 | 8,10 | 152,539,32 | 8,1510 | 6,31 | 99,935,09 | 4,4255 | 5,08 | | |||||
| Кетамин | - | - | - | 147,6414,62 | 12,7193 | 9,90 | 101,565,19 | 4,5210 | 5,11 | | |||||
| Сиднокарб | 217,1617,52 | 15,2442 | 8,06 | - | - | - | 145,7510,58 | 9,2093 | 7,26 | | |||||
| Флуоксетин | 192,6445,96 | 39,9660 | 23,86 | - | - | - | 160,0816,58 | 14,4332 | 10,36 | | |||||
Доказаны высокая специфичность, прецензионность и линейность разработанных методик химико-токсикологического анализа кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба.
Разработка схемы исследования случаев комбинированных отравлений.
При применении разработанной методики для исследований практических экспертных случаев отмечены отравления кетамином, мидокалмом, флуоксетином и сиднокарбом в сочетании с другими широко распространенными лекарственными препаратами: димедрол (метаболит - бензгидрол), прометазин (метаболит - сульфоксид прометазина), тиопентал - натрия, амитриптилин.
На «модельных смесях» определен выход димедрола, дипразина, тиопентала, амитриптилина и их метаболитов при использовании разработанной методики
Использование разработанной методики химико-токсикологического анализа позволяет достигать достаточно высокий выход из тканей внутренних органов: тиопентала – натрия 65%, дипразина 70%, сульфоксида 60%, димедрола 50%, бензгидрола 30%, амитриптилина 80%.
Схема исследования комбинированных отравлений представлена на рис. 3. Использовали ТСХ-скриниг и ВЭЖХ с базой данных «БД-2003-350».
ТСХ-скрининг проводили по модифицированной методике Карташова В.А. на пластинках «Sorbfil» (метчики: хинин, аминазин, амидопирин, дибазол). После определения хроматографической группы (подгруппы) идентифицируемых препаратов проводили подтверждающие качественные реакции.
Дальнейшую идентификацию и количественный анализ целесообразно проводить методом ВЭЖХ с использованием базы данных «БД-2003-350».
Биологический материал
Изолирование
ТСХ-скрининг
ВЭЖХ
Анализ хроматограммы
-Исключение пиков «холостого градиента»;
-Исключение фоновых пиков биологического материала;
-Исключение пиков мало токсичных веществ;
-Идентификация остальных пиков.
Положительный результат:
-Определение хроматографических групп и подгрупп;
-Предварительная идентификация производных фенотиазина, пиразолона, барбитуровой кислоты;
-Предварительная иденти-фикация кетамина, сиднокарба, флуоксетина и мидокалма.
Отрицательный результат
Количественное определение
.
Рис. 3 Схема исследования случаев комбинированных отравлений исследуемых производных фенилалкиламина в сочетании с некоторыми лекарственными средствами.
Исследование сохраняемости кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба в биологическом материале.
Важное значение для проведения химико-токсикологического анализа имеет сохраняемость лекарственных веществ в биологическом материале.
Для изучения сохраняемости мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба определили степень разложения в тканях печени при хранении образцов в различных условиях. Определено влияние на разложение исследуемых препаратов пониженной температуры (от –2,0 до +2,0С) и добавление спирта этилового 96% в соотношении 1:1.
Исследование проводили по общепринятой методике с применением «модельных смесей» (Крамаренко В.Ф., 1989 г.).
У
становлено, что оптимальные условия хранения биологических образцов, содержащих кетамин, флуоксетин и сиднокарб: температура холодильной камеры от –2,0 до +2,0С, мидокалм - дополнительная фиксация спиртом этиловым 96% (рис. 4).
Рис. 4 Результаты определения степени разложения исследуемых веществ при использовании оптимальных условий хранения
Предельные сроки хранения образцов составляют: в случае содержания кетамина и мидокалма – 90 суток (степень разложения соответственно 33% и 48%), флуоксетина - 30 суток (степень разложения 20%). Полное разложение исследуемых веществ в биологических объектах наблюдается при хранении 180 дней.
Сиднокарб в биологическом материале подвергается разрушению при хранении образцов 30 суток (степень разложения 78%), поэтому для повышения результативности химико-токсикологического исследования секционный материал необходимо направлять сразу после забора.
Общие выводы:
- Определены оптимальные значения факторов экстрагирования исследуемых веществ: мидокалм и кетамин - рН= 9,0-10,0, экстрагент - хлороформ; флуоксетин - рН=6,0-8,0, экстрагент - углерод четыреххлористый; сиднокарб - два максимума на кривой экстракции, обусловленные наличием двух таутомерных форм сиднониминового цикла: рН=3,0-4,0, экстрагент - эфир диэтиловый и рН=8,0-10,0, экстрагенты углерод четыреххлористый и эфир диэтиловый.
- Разработаны методики изолирования мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба из биологических жидкостей и тканей внутренних органов, обеспечивающие суммарный выход кетамина – кровь - 72%, моча - 95%, органы - 59%; мидокалма: кровь - 80%, моча - 94%, органы - 86%; флуоксетина: кровь - 38%, моча - 55%, органы - 43%; сиднокарба: кровь - 20%, моча - 44%, органы - 41%).
- Подобраны оптимальные условия очистки методом ТСХ: на пластинах «Sorbfil», элюент - спирт этиловый 96%, обеспечивающие минимальные потери: кетамина - 22%, флуоксетина - 30%, сиднокарба - 27%, мидокалма - 20%.
- Изучены спектральные характеристики сиднокарба, кетамина, мидокалма, флуоксетина в УФ-области. Выявлена возможность использования дифференциального спектра для идентификации сиднокарба (при изменении рН происходит смещение максимумов оптической плотности в интервале 235-253 нм и 294-335 нм); сольватохромных эффектов для флуоксетина (гиперхромный эффект) и мидокалма (батохромный и гипохромный эффекты).
- Разработаны методики идентификации исследуемых производных фенилалкилминов методом ТСХ при использовании в качестве подвижных фаз: спирт н-бутиловый, хлороформ - ацетон (7:3) и спирт н-бутиловый – эфир диэтиловый (8:2) и проявителей: реактивов Драгендорфа, Бушарда, раствора нингидрина в спирте н-бутиловом 1%, раствора калия йодплатината 5%, раствора натрия нитропруссида 5%.
- Определены оптимальные условия разделения кетамина и мидокалма методом ГЖХ, позволяющие проводить их идентификацию и количественное определение в биологических объектах: программирование температуры, капиллярная колонка с привитой НЖФ SE-30. Пределы обнаружения 100 мкг в 100 мл биологической жидкости и 150 мкг в 100 г внутренних органов.
- Подобраны оптимальные условия для проведения идентификации и количественного определения кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба в извлечениях из биологических объектов методом ВЭЖХ: градиентный режим, обращенно - фазная колонка. Пределы обнаружения: мидокалм и кетамин 30 мкг в 100 мл биологической жидкости и 50 мкг в 100 г внутренних органов; флуоксетин и сиднокарб- 50 и 100 мкг соответственно.
- Разработана схема анализа трупного материала в случаях комбинированных отравлений мидокалмом, кетамином, флуоксетином и сиднокарбом с амитриптилином, дифенилгидрамином (димедролом), прометазином (дипразином) и тиопенталом- натрия, включающий в себя изолирование, ТСХ и ВЭЖХ скрининг. Установлены значения выходов веществ из тканей печени при использовании разработанной методики.
- Изучена сохраняемость кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба в трупном материале. Установлены оптимальные условия хранения экспертного материала: температура холодильной камеры от –2,0 до +2,0С и фиксация спиртом этиловым 96%.
Выявлены максимальные сроки хранения образцов биологического материала: для определения кетамина и мидокалма - 90 суток, флуоксетина - 30 суток. Исследование сиднокарба необходимо проводить непосредственно после забора образцов.
В заключение благодарим заведующую химическим отделением Алтайского краевого бюро судебно-медицинской экспертизы Воронкову Л.Г. и ведущего эксперта Царева В.И. за помощь и сотрудничество при проведении экспериментальных исследований.
По теме диссертации опубликованы следующие работы:
- Исследование сиднокарба в химико-токсикологическом отношении // Актуальные вопросы судебной и клинической медицины- Барнаул, 2003.-С.34-35 (соавт. Воронкова Л.Г.)
- Разработка оптимальной методики химико-токсикологического анализа сиднокарба // Молодежь – Барнаулу 2003. Материалы научно-практической конференции. –Барнаул, 2003.- С 47 (соавт. Федосеева Л.М.)
- О возможности применения классических методик изолирования в химико-токсикологическом анализе сиднокарба // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов. – Пятигорск, 2004. – Вып. 59. – С.170-172 (соавт. Федосеева Л.М.)
- Поиск оптимальных условий изолирования сиднокарба // Молодежь – Барнаулу 2004. Материалы научно-практической конференции. –Барнаул, 2004.- С. 195-196 (соавт. Федосеева Л.М.)
- Модификация метода ТСХ-скрининга ядовитых и сильнодействующих азотсодержащих органических оснований // VI конгресс молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» – Томск, 2005. – С. 94 (соавт. Федосеева Л.М.)
- Разработка комплексного химико-токсикологического анализа мидокалма // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики- Барнаул, 2005.- С.34-38
- Изучение спектральных характеристик препаратов-производных фенилалкиламина (сиднокарба, кетамина, мидокалма) // Молодежь – Барнаулу 2005. Материалы научно-практической конференции. –Барнаул, 2005.- С 23. (соавт. Федосеева Л.М.)
- Анализ препаратов группы фенилалкиламинов методом тонкослойной хроматографии // «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов». – Пятигорск, 2005. – Вып. 60. – С.226-228 (соавт. Федосеева Л.М.)
- Разработка методики идентификации некоторых препаратов- производных фенилалкиламина в условиях химико-токсикологического анализа // Приоритеты фармацевтической науки и практики: Материалы заочной международной конференции- Москва, 2006.- С-261-263 (соавт. Федосеева Л.М.)
- Выбор оптимально экстрагента мидокалма из биологического материала // Материалы национальной научно-практической конференции с международным участием: «Состояние, перспективы судебно-токсикологической службы и научных исследований» –Харков, 2006.- С 48 (соавт. Федосеева Л.М.)
- Опыт использования базы данных «БД-2003-250» на жидкостных хроматографах «Милихром-А02» при судебно-химических исследованиях // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики- Новосибирск-Красноярск, 2007.- С 46-51 (соавт. Заздравных Н.А.)
- Химико-токсикологический анализ кетамина // Фармация. – 2007. - № 8. – С. 6-9. (соавт. Федосеева Л.М.)*
- Анализ использования метода ВЭЖХ на хроматографах «Милихром А-02» в химико-токсикологическом анализе.// Аналитические методы и приборы для химического анализа- Санкт-Петербург, 2007.- С 17-23 (соавт. Воронкова Л.Г.)
- Химико-токсикологический анализ препарата флуоксетин // Судебно-медицинская экспертиза. – 2008. - № 4. – С. 31-35 (соавт. Воронкова Л.Г.)*
- Разработка методики изолирования кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба // Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа –Пермь, 2009.-С. 57-59 (соавт. Федосеева Л.М.)
Казарцев Илья Александрович (Россия)
Химико-токсикологический анализ некоторых производных фенилалкиламина (мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба).
В результате проведенных исследований определены условия изолирования кетамина, сиднокарба. флуоксетина и мидокалма из биологических жидкостей и тканей внутренних органов. Установлены оптимальные условия разделения, способы детектирования и количественного определения кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба в извлечениях из биологического материала различными физико-химическими методами анализа. Проведена валидация разработанной методики, определены показатели: пределы обнаружения и количественного определения в 100 г биологического объекта, сходимость результатов (прецензионность), правильность, линейность. Показана возможность использования разработанной методики химико-токсикологического анализа для решения различных научных и практических задач, в частности для изучения сохраняемости мидокалма. флуоксетина, сиднокарба и кетамина при гнилостном разложении трупного материала.
Kazarcev Ilia (Россия).
Analytical toxicology of some derivatives phenylalkylamines (mydocalm, ketamine, fluoxetine and sydnocarb).
In the result of the research defined the conditions of isolation mydocalm, ketamine, fluoxetine and sydnocarb of biological fluids and tissues of internal organs. Optimum conditions of separation, methods of quantative and quantitative determination of mydocalm, ketamine, fluoxetine and sydnocarb in extracts from biological material of different physical-chemical methods of analysis. Carried out the validation of the developed method, defined indicators: the limits of detection and quantification in 100 g of a biological object, the convergence of the results, the accuracy, linearity. The possibility of use of the developed methods of analytical toxicology for the solution of various scientific and practical tasks, in particular for the study of the preservation of mydocalm, ketamine, fluoxetine and sydnocarb at putrid the decomposition of the corpse of the material.