Оптимизация системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого скота 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология; 16.
| Вид материала | Автореферат |
- Совершенствование системы ветеринарно-профилактических мероприятий и её влияние, 471.82kb.
- Иммунный статус поросят при пневмонии, вызванной вирусом репродуктивно-респираторного, 398.05kb.
- Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов, 1127.13kb.
- Эпизоотологический мониторинг и иммунопрофилактика классической чумы свиней и болезни, 755.76kb.
- «Коксиеллез-ассоциированная инфекция крупного рогатого скота и усовершенствование лабораторных, 460.33kb.
- Темы рефератов для поступления в аспирантуру по научной специальности 06. 02. 02 ветеринарная, 14.27kb.
- Кудряшова жанна Алексеевна Теоретические и практические аспекты новых подходов профилактики, 392.23kb.
- Программа вступительного экзамена в аспирантуру по специальной дисциплине 06. 02., 270.79kb.
- Получение и использование моноклональных антител в диагностике гриппа птиц 16. 00., 455.11kb.
- Терапевтическая эффективность гинодиксина при эндометритах и маститах у коров, вызванных, 301.79kb.
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 48 научных работ, в том числе 11 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ (“Ветеринария”, “Аграрная наука”, “Достижения науки и техники АПК”, “Молочное и мясное скотоводство”, “Сибирский вестник сельскохозяйственной науки”).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 325 страницах, содержит 52 таблицы, 6 рисунков, и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы и практические предложения, список использованной литературы, приложения. Список использованной литературы включает 658 источников, в том числе 180 зарубежных авторов.
Внедрение результатов исследований. Результаты научных исследований нашли отражение в “Правилах по профилактике и ликвидации некробактериоза животных”, N ВП 13.4.1313-00 от 11.07. 2000 г., утвержденных Департаментом Ветеринарии Минсельхозпрода России.
На основании результатов исследований подготовлена нормативно-техническая документация на препарат некрогель, прошедшая экспертизу в ФГУ “ВГНКИ” для утверждения в Россельхознадзоре Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору МСХ РФ.
По результатам исследований разработаны две научно-методические рекомендации, которые рассмотрены подсекцией “Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока отделения ветеринарной медицины РАСХН протокол №4 от 04.05.05 г. и № 6 от 23.09.05 г. и рекомендованы для использования в оленеводческих хозяйствах и в научных исследованиях.
Депонирован штамм Fusobacterium necrophorum ИВ B-845 в Научно-исследовательском институте Коллекции культур микроорганизмов (НИИ ККМ) Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии “Вектор (справка № 0100 от 18 сентября 2000 г.).
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Обоснование необходимости совершенствования системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого скота.
2. Данные по усовершенствованному методу диагностики некробактериоза сельскохозяйственных животных.
3. Результаты исследований по изучению роли специфической профилактики в системе контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого.
4. Данные по оздоровлению неблагополучных по некробактериозу хозяйств с разной эпизоотической ситуацией неспецифическими методами.
5. Результаты разработки и испытания препаратов для лечения больных некробактериозом животных.
Автор выражает глубокую признательность и благодарность доктору ветеринарных наук, профессору, заведующему лабораторией некробактериоза животных А.А. Самоловову за консультационную помощь; доктору ветеринарных наук, профессору С.К. Димову и доктору ветеринарных наук А.А. Колосову за методическую помощь; доктору ветеринарных наук, профессору А.Г. Хлыстунову, кандидату ветеринарных наук, научному сотруднику лаборатории некробактериоза животных Т.М. Магеровой, кандидату ветеринарных наук, заведующему лабораторией генной инженерии В.И. Семенихину, доктору ветеринарных наук, директору ГНУ НИИСХ КС К.А. Лайшеву, ветеринарному врачу Управления ветеринарии Таймырского АО С.Г. Самойлову за участие в выполнении некоторых фрагментов диссертации.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Методы исследований и объем работы. Работа выполнена в 19912006 гг. в лаборатории некробактериоза животных ГНУ ИЭВСиДВ, животноводческих хозяйствах региона Сибири в соответствии с планами научно-исследовательских работ.
Диагноз на некробактериоз животных устанавливали согласно “Методическим указаниям по лабораторной диагностики некробактериоза”, (1987). Эпизоотологическое обследование хозяйств Новосибирской, Томской областей и Алтайского края проводили по методическим рекомендациям “Методы эпизоотологических исследований” С.И. Джупины и А.А. Колосова, (1991) с определением условий содержания и кормления.
Оценку питательности рационов кормления животных осуществляли по обменной энергии и питательным различным веществам согласно “Нормам и рационам кормления сельскохозяйственных животных”, А.П. Калашников с соавт., (1985), “Практикуму по кормлению сельскохозяйственных животных”, Е.А. Петухова с соавт., (1990).
Для диагностики некробактериоза биоматериал (пораженная фаланга) брали от животных в хозяйствах с выраженными клиническим признаками, абсцессы печени отбирали при убое животных на Новосибирском мясокомбинате. Диагностика некробактериоза включала микроскопию мазков из патологического материала, посевы на питательные среды и заражение лабораторных животных. В качестве питательных сред использовали среду Китта-Тароцци, аминокровин-сывороточный бульон, мясопептонный бульон.
Параллельную пробу материала передавали в лабораторию генной инженерии для исследования методом ДНК- технологии. По окончании исследований проводили сравнение полученных результатов бактериологической диагностики с методом ПЦР.
Изучение влияния нормализации обмена веществ и улучшение санитарных условий содержания на заболеваемость животных некробактериозом выполняли в научно-производственных опытах. В хозяйствах с высокой заболеваемостью был осуществлен ряд организационно-хозяйственных мер для улучшения условий содержания, а именно реконструкция длины стойл, применение подстилки, моцион, изменение рациона кормления, в который были включены больше грубых кормов, и витаминно-минеральные подкормки (премиксы).
Учет и анализ биохимических показателей сывороток крови животных проводили по данным экспертиз ветеринарных лабораторий Новосибирской области и Алтайского края.
Для определения показателей естественной резистентности организма животных пробы крови (сыворотки) отбирали в хозяйствах, благополучных и неблагополучных по некробактериозу животных. В каждом хозяйстве по принципу аналогов сформировали контрольные и опытные группы по 6 голов в каждой. В контрольной группе находились клинически здоровые животные, в опытной – больные некробактериозом. Перед взятием крови учитывали общую заболеваемость коров некробактериозом по стаду.
Естественную резистентность организма крупного рогатого скота оценивали по фагоцитарной активности (ФА), лизоцимной активности (ЛА), бактерицидной активности (БА) согласно методическим рекомендациям “Оценка естественной резистентности крупного рогатого скота и овец” (П.Н. Смирнов с соавт., 1989).
Морфологические, протеолитические биохимические, патогенные и гемагглютинирующие свойства культур F. necrophorum изучали согласно методикам Т.С. Костенко, Е.И. Скаршевской, С.С. Гительсона (“Практикум по ветеринарной микробиологии”, 1989), работе В.А. Гришанина, В.Д. Бадикова (“Культивирование микроорганизмов в лабораторных условиях”, 1999).
Опытную экспериментальную инактивированную гидроокисьалюминиевую вакцину (ГОА ИЭВСиДВ) конструировали из штамма Fusobacterium necrophorum ИВ В-845.
Крупный рогатый скот иммунизировали в хозяйствах с разной эпизоотической ситуацией по некробактериозу крупного рогатого скота. По принципу аналогов формировали опытные и контрольные группы животных. Экспериментальную гидроокисьалюминиевую вакцину вводили подкожно в дозе 3 мл, двукратно с интервалом 3 недели, с ревакцинацией через 5 месяцев. Вакцины нековак и инактивированную эмульгированную (ВИЭВ) применяли согласно наставлениям по их применению. Коров контрольной группы не вакцинировали.
Перед началом опыта, а затем каждый месяц от 6–10 модельных животных опытных и контрольной групп исследовали сыворотки крови на наличие антител в реакции агглютинации (РА).
Профилактическую эффективность вакцин определяли ежемесячно по титру антител сыворотки крови, определяемых в реакции агглютинации (РА), а также по заболеваемости животных в опытных и контрольных группах.
Неспецифические мероприятия при оздоровлении от некробактериоза животных проводили в неблагополучных хозяйствах по результатам эпизоотологического обследования, руководствуясь положениями общей эпизоотологии (А.А. Конопаткин, И.А. Бакулов, Я.В. Нуйкин и др. “Эпизоотология и инфекционные болезни сельскохозяйственных животных”, 1984).
В лаборатории института составляли прописи и изготавливали препараты. Апробацию препаратов для лечения некробактериозных поражений конечностей крупного рогатого скота проводили в хозяйствах, неблагополучных по данной болезни. В составе препаратов не были включены лекарственные вещества, негативно влияющие на организм животных и качество животноводческой продукции.
Лечение крупного рогатого скота с инфицированными ранами дистальных отделов конечностей осуществляли следующим образом. Первоначально выполняли туалет раны с удалением гноя и свободнолежащих нежизнеспособных тканей с применением 0,25%-го раствора перманганата калия. По возможности иссекали все некротизированные ткани, вскрывали ниши карманы. Далее орошали раневую поверхность 3%-ным раствором перекиси водорода, обсушивали ватно-марлевым тампоном. Наносили испытуемые препараты и накладывали марлевую повязку с интервалом 2–3 дня. Лечебный эффект действия препаратов сравнивали с контрольной группой животных, раны которых обрабатывали общепринятыми средствами.
Антимикробную активность разрабатываемых лечебных средств определяли методом серийных разведений препарата в питательной среде по методу Е.П. Сиволодского (1999) “Методы определения чувствительности, устойчивости и толерантности микроорганизмов к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам”. В качестве тест-микробов использовали референтные штаммы и полевые изоляты, выделенные от больных некробактериозом животных. Антибактериальную активность препаратов выражали в минимальной ингибирующей концентрации (МИК) в мкг/мл.
Изучение токсичности мази некрогель выполняли согласно “Методическим указаниям по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве” (Л.П. Маланин, А.П. Морозов, А.С. Селиванова, 1988). Расчет LD50 осуществляли при помощи статистического метода Г.Н. Першина (“Элементы количественной оценки фармакологического эффекта” М.Л. Беленький, 1963). Испытание на стерильность некрогеля определяли методом мембранной фильтрации (“Государственная фармакопея СССР”, XI издание, 1989).
Для постановки клинических экспериментов опытные и контрольные группы животных формировали по принципу аналогов. В контрольных группах животных лечили традиционными лекарственными средствами в соответствии с действующими наставлениями.
Производственное испытание разрабатываемых препаратов проводили в неблагополучных хозяйствах Новосибирской области, Алтайского края, в Республиках Татарстан и Хакасия, в Таймырском автономном округе. Животных в опытных группах лечили испытуемыми лечебными средствами согласно разработанных нами наставлений по их применению, контрольных – традиционными препаратами (присыпка Плахотина, Островского, мазь Вишневского, левотетрасульфин). В течение 30 дней с начала лечения учитывали количество выздоровевших животных и сроки их выздоровления. Лечебную эффективность препаратов оценивали по количеству выздоровевших животных и продолжительности их лечения.
Экономическую эффективность комплексной системы мероприятий по оздоровлению от некробактериоза животных и применения препарата некрогель в неблагополучных хозяйствах определяли по “Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий”, утвержденной начальником Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России 21 февраля 1997 г.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методами математической статистики (М.Г. Таршис, В.М. Константинов, 1975, Г.Ф. Лакин, 1980, А.А. Самоловов, 1990). Степень достоверности полученных показателей определяли путем сравнения величин вариационных рядов с помощью критерия Стьюдента.
Для испытания вакцин было использовано 4240 голов крупного рогатого скота. Неспецифические мероприятия по оздоровлению от некробактериоза применяли на поголовье 9520 животных.
Препараты для лечения испытаны на 17350 головах крупного рогатого скота, 421 северном олене.
При проведении работы использовано около 560 белых нелинейных мышей с массой тела 1820 г, 25 кроликов с массой тела 2,02,5 кг, 15 морских свинок с массой тела 400500 г, 16 белых нелинейных крыс с массой тела 150200 г.
2.2 Результаты исследований
2.2.1 Обоснование необходимости совершенствования системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого скота в связи с многообразием форм его проявления
Некробактериоз сельскохозяйственных животных в большинстве случаев научными работниками и практическими ветеринарными специалистами ассоциируется с гнойно-некротическими поражениями в области дистального отдела конечностей. Однако с интенсификацией животноводства, связанной с концентрацией животных, введением силосно-концентратного типа кормления и высокой механизацией производственных процессов, стали регистрировать поражения некробактериозной этиологии и других органов. Так, в США у крупного рогатого скота, убиваемого на мясо, в среднем у 1232% животных регистрируют абсцессы печени (D.R. Brink et al., 1990), при этом в отдельных группах они могут варьировать от 1 до 95% (T.G. Nagaraja, M. M. Chengappa, 1998).
Принимая во внимание, что возбудитель некробактериоза является постоянным обитателем рубца жвачных, S. Narayanan et al. в 1997 г. подтвердили генетическую однотипность изолятов Fusobacterium necrophorum, выделенных из абсцессов печени и пораженного эпителия рубца, а T.G. Nagaraja et al. (1999) доказал, что снижение концентрации Fusobacterium necrophorum в содержимом рубца способствует уменьшению инцидентности абсцессов в печени.
Этому также способствует увеличение доли грубых кормов в рационе (R.A. Zinn, A. Plascencia, 1996), о чем, на основании своих исследований, убедительно показали T.G. Nagaraja, M.M Chengappa (1998), заключив, что наибольшая инцидентность абсцессов печени регистрируется в откормочных хозяйствах с преобладанием высококонцентратного типа кормления.
Наши исследования также показали, что в животноводческих хозяйствах Сибири достаточно широко распространена патология печени в виде абсцессов. Так, по данным ветеринарно-санитарной экспертизы животных, убиваемых на Новосибирском мясокомбинате, абсцессы печени установлены в 25,4% хозяйств, поставлявших скот, с инцидентностью от 2,1 до 35,2% животных, достигая в отдельных случаях 4080%.
Таким образом, в настоящее время считается, что основными факторами, способствующими возникновению абсцессов печени, являются всевозможные нарушения кормления животных, в том числе несбалансированность рационов по количеству и типу кормов. Объясняется это тем, что стенка рубца, подверженная высокой кислотности из-за несбалансированного кормления и действия инородных предметов, становится восприимчивой к вторжению и колонизации возбудителя, который, обладая адгезивными свойствами по отношению к эпителию рубца, через кровь попадает в печень.
По нашим многолетним наблюдениям, в Сибири у крупного рогатого скота в основном поражается кожа конечностей в области мякишей, межкопытцевого свода и венчика. В то же время зарубежные исследователи из США, Великобритании, Италии поражения мягких тканей дистального отдела конечностей подразделяют на четыре формы клинического проявления (D.G. Baggot, 1978, R.W. Blowey, 1994, S.L. Berry, 1997, С. Bergsten, 1999).
Тем не менее, мы наблюдали несколько форм клинического проявления некробактериоза. Некоторые из них ранее не отмечены (поражения сосков вымени, фрагментов кожи в области рудиментарных копытцев).
В ЗАО “Авангард” Усть-Таркского района Новосибирской области инфекционным заболеванием было поражено 350 дойных коров, или 70% стада. Болезнь протекала в летний период (июль – август). В этот период часто шли дожди.
Клинические признаки болезни – поражение кожи в области рудиментарных копытцев задних конечностей. Пораженные участки имели форму полосок размером 2,5–3,01,0–2,0 см. В начальной стадии развития заболевания отмечали отечность, гиперемию кожи, болезненность при пальпации, хромоту, повышение местной температуры. Во второй стадии заболевания образовывалась рана в виде язвы. Поверхность раны покрыта фибринозно-гнойным экссудатом, на ней были участки некроза. Раневая поверхность была сухой; корочки фибринозного экссудата отторгались на 3–4-й день, образуя язву.
Одним из основных факторов, способствующих появлению некробактериоза, являлась сырость на пастбище и в загонах. Заболеваемость коров некробактериозом прекратилась в конце августа, когда установилась сухая погода.
Второй случай некрабактериоза отмечен в пастбищный период в ЗАО “Целинный” Коченевского района Новосибирской области. Заболеванию был подвержен молодняк в возрасте 12 мес.: 60% телочек из 450 голов и 50% бычков из 320 голов. У животных поражались участки кожи над венчиком задних конечностей. Клинические признаки заболевания: хромота, образование воспалительного отека, что сопровождалось припуханием кожи и повышением местной температуры. Затем развивался абсцесс, с последующим образованием язвы; от раны исходил запах сероводорода. Появление болезни было связано с травмированием стеблями сухой травы кожи конечностей в результате засушливого жаркого лета.
Третий случай клинического проявления некробактериоза связан с поражением кожи сосков вымени. Эта форма некробактериоза была отмечена у высокоудойных коров в одном из хозяйств Новосибирской области. При осмотре кожи сосков обнаруживались гнойно-некротические язвы. Бактериологическим исследованием выделили чистую культуру, патогенную для белых мышей. Поражения кожи сосков вымени были вызваны травмированием ее резиной стаканов доильных аппаратов в процессе доения.
Поражение мышечной ткани тазовых конечностей при некробактериозе наблюдали в нескольких хозяйствах Сибири (Новосибирская и Томская области, Красноярский край). В этих хозяйствах некробактериозом заболевали высокопродуктивные коровы и первотелки. Коровы не хромали; дистальный отдел конечностей не поражался. При убое животных отмечали гнойно-некротические поражения мышц тазового пояса, бедренной кости и эпифизарной части костного мозга. Мышечная ткань была вишневого цвета, дряблой консистенции, от нее исходил неприятный запах. Костная ткань эпифиза на разрезе наполнена кровью, костный мозг серо-коричневого цвета, мягкой консистенции.
Согласно данным других исследований, с интенсификацией откорма крупного рогатого скота участились случаи появления гнойного воспаления тканей хвоста, вызванные возбудителем некробактериоза F. necrophorum. Они связывают это с односторонним кормлением бычков и неудовлетворительными условиями содержания (Л.А. Сергеева и П.Н. Баканов, 1982; А.А. Самоловов, 1989; P. Klucznick, 1976; W.Goldhorn, 1984).
Имеются сообщения об этиологической роли F. necrophorum в воспалении половых органов (I.M. Sheldon et al., 2004; E. J. Williams et al., 2005) и вымени животных (T. Shinjo, 1983). Эндометриты встречаются у 20–40% коров после отела. По данным зарубежных исследователей, этиология послеродовых болезней у коров может быть связана со следующими возбудителями: Arcanobacterium pyogenes, Fusobacterium necrophorum, Bacteroides melaninogenicus. Синергизм между Arcanobacterium pyogenes и Fusobacterium necrophorum усиливает их вирулентность, в результате чего эндометрит у коров протекает очень тяжело. Fusobacterium necrophorum продуцирует лейкотоксин, который способствует распространению Arcanobacterium pyogenes в ткани органов животных. В то же время, Arcanobacterium pyogenes вырабатывает фактор роста для Fusobacterium necrophorum (R.A. Laven, A.R. Peters, 1996; G.S. Lewis, 1997; E. Malinowski, 2004).
М.Н. Коннов, В.Г. Гумеров, В.Г. Гафаров и др., (2003), М.Н. Коннов (2004) в результате вирусологических и бактериологических исследований доказали, что этиологическими агентами, вызывающими инфекционный баланопостит откормочных бычков, являются герпесвирус типа 1 и бактерии Fusobacterium necrophorum. Впервые установлено, что баланопостит у откормочных бычков протекает, в основном, в виде смешанной инфекции.
В КП “Беклемишевское” Читинской области поражение бычков некробактериозом в форме баланопостита составляло до 35% (А.А. Ежинов, Б.Н. Бубеев, А.В. Волченко, 2002; Б.Н. Бубеев, 2004).
При лабораторном исследовании проб секретов из сосков вымени коров в летний период содержания в 35% случаев выделяли Corynebacterium pyogenes, Peptococcus indolicus – 31% и Fusobacterium necrophorum – 22% (J.M. Van Den Bogaard, M.J. HazenU Vecht, 1987).
Некробактериозные поражения хвоста были отмечены у бычков на откорме в одном из хозяйств Новосибирской области. Заболевали бычки, находившиеся на втором периоде откорма. Болезнью было охвачено 23,5% животных.
Следовательно, некробактериоз животных следует рассматривать не как местное поражение тканей дистального отдела конечностей, а как системное заболевание, которому свойственен эпизоотический процесс. Ведущими же факторами, влияющими на степень его проявления, выступают условия кормления и содержания. Исходя из этих положений, необходимо совершенствовать диагностические, лечебные и профилактические мероприятия.
2.2.2 Совершенствование методов диагностики некробактериоза сельскохозяйственных животных
2.2.2.1 Усовершенствование метода отбора биоматериала из пораженной конечности для лабораторного исследования
По данным экспертиз районных и областных ветеринарных лабораторий в большинстве случаев диагноз на некробактериоз не подтверждается. Одной из причин таких заключений лабораторий мы связываем с трудоемкостью взятия для бактериологического исследования некротизированных тканей из пораженного пальца внутри роговой капсулы. Второй причиной, на наш взгляд, является то, что некротизированные участки тканей для исследования отбираются с поверхности пораженного органа. На поверхности пораженных тканей органа присутствует, как известно, большое количество аэробных микроорганизмов. А возбудитель некробактериоза относится к анаэробным микроорганизмам и в пораженном органе находится глубоко, на границе здоровой и некротизированной тканей.
Для исследования в лабораторию направляют обычно пораженную фалангу по путовый сустав. Взятие из глубины пораженной фаланги некротизированных фрагментов тканей скальпелем, ножницами, пинцетом или ложкой Фолькмана, как правило, всегда очень затруднительно.
Мы предлагаем пораженную фалангу механически расчленить на несколько фрагментов (34), в зависимости от степени поражения. Затем в боксе из пораженных участков фаланги ложкой Фолькмана, скальпелем, ножницами или пинцетом, предварительно обработанных 70% спиртом или подвергнутых фломбированию над пламенем горелки, отбирают пробы некротизированных тканей для исследований. Дальнейшее бактериологическое исследование проводят согласно “Методическим указаниям по лабораторной диагностике некробактериоза” (1987).
При исследовании 15 пораженных конечностей диагноз на некробактериоз подтвердился при усовершенствованной методике отбора биологического материала для лабораторного исследования в 93,3 % случаев, а при обычной методе в 60%.
Таким образом, новый метод отбора биоматериала из пораженной конечности способствовал увеличению эффективности диагностики некробактериоза на 33,3% и может быть рекомендован для ветеринарных диагностических лабораторий.
2.2.2.2 Сравнительная эффективность индикации Fusobacterium necrophorum бактериологическим методом и с помощью гнездовой ПЦР
Исследования по разработке гнездовой ПЦР для диагностики некробактериоза проводили совместно с лабораторией генной инженерии (заведующий В.И. Семенихин). Нами проводилась индикация возбудителя некробактериоза и сопутствующей микрофлоры, накопление бактериальной массы, и взятие биологических образцов.
Первоначально проверена специфичность разрабатываемой диагностической тест-системы. Положительные анализы продуктов ПЦР получали только тогда, когда в качестве матрицы использовали ДНК патогенного возбудителя F.necrophorum subsp. necrophorum. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК других бактерий: стафилококков, стрептококков, кишечной палочки, протея, микоплазмы.
Затем провели тестирование возбудителя некробактериоза в пробах, полученных от коров из разных хозяйств Кемеровской, Новосибирской областей и Алтайского края. Пробы были взяты от животных по клиническим показаниям.
Во всех случаях бактериологическое исследование биоматериала из пораженных конечностей (фаланга, костный мозг фаланги, кровь фаланги) при положительной биопробе на белых мышах совпадало с положительным результатом ПЦР, преимущественно с внутренним праймером (табл.1).
При исследовании абсцессов печени совпадение бактериологического исследования и ПЦР составило 50%.
Таблица 1 – Результаты сравнительных исследований биологических
образцов на некробактериоз
| № проб | Исследуемый материал | Бактериологическое исследование | ПЦР с праймерами | |||
| питательные среды и биопроба | получена чистая культура | наружные | внутренние | |||
| 1 | Фаланга 1 | + | + | | + | |
| 2 | Фаланга 2 | + | | | + | |
| | 3 | Фаланга 3 | + | | | + |
| | 4 | Фаланга 4 | + | + | | + |
| | 5 | Фаланга 5 | + | + | | + |
| | 6 | Фаланга 6 | + | | | + |
| | 7 | Фаланга 7 | + | | | + |
| | 8 | Фаланга 8 | + | | | + |
| | 9 | Фаланга 9 | + | + | | + |
| | 10 | Фаланга 10 | + | + | | + |
| 11 | Костный мозг фаланги | + | + | + | + | |
| | 12 | Кровь фаланги | + | | | + |
| 13 | Абсцесс печени 1 | + | | | | |
| 14 | Абсцесс печени 2 | + | | | | |
| 15 | Абсцесс печени 3 | + | + | | | |
| 16 | Абсцесс печени 4 | + | | | + | |
| 17 | Абсцесс печени 5 | + | | | + | |
| 18 | Абсцесс печени 6 | + | + | | + | |
| | 19 | Абсцесс мышц | + | | | + |
| | 20 | Биоматериал от мыши | + | | + | + |
| | 21 | Некротич. очаг от мыши | + | | | + |
| 22 | F. necroph. из коллекции | + | + | | + | |
| | 23 | F. necrophorum лиофилизиров. 1 | + | н/и | | + |
| | 24 | F. necrophorum лиофилизиров. 2 | + | н/и | | + |
| | 25 | F. necrophorum. | + | + | | + |
Примечание: “ + ” положительный результат,
“ ” отрицательный результат
Разработанная диагностическая тест-система полимеразной цепной реакции с гнездовыми праймерами обладает строгой специфичностью и позволяет выявлять в биологических образцах патогенный биотип АВ F. necrophorum subsp. necrophorum.
Диагностическое исследование биологических образцов из пораженных конечностей на некробактериоз бактериологическим методом и полимеразной цепной реакцией тождественно.
ПЦР с гнездовыми праймерами для выявления F. necrophorum subsp. necrophorum может быть использована в качестве экспресс-метода для диагностики кожной формы некробактериоза.
2.2.3 Определение роли специфической профилактики в системе контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого скота.
2.2.3.1 Регламент получения антигена Fusobacterium necrophorum и
постановка реакции агглютинации
В настоящее время нет единого антигена для обнаружения антител против возбудителя некробактериоза F. necrophorum. Каждый исследователь готовит собственный антиген (АГ) для РА на основе полученных изолятов. В доступной отечественной литературе мы не встретили работ, сообщающих о методике изготовления антигена F. necrophorum для РА, утвержденной директивными органами РФ. Ранее в своих исследованиях РА использовали ученые ВИЭВ (Я.Р. Коваленко, 1948, А.Р. Мусаев, 1993), НИИСХ Крайнего Севера (О.И. Соломаха, 1973).
Исходя из имеющихся сведений, мы поставили перед собой задачу разработать регламент приготовления АГ F. necrophorum и методику постановки РА.
2.2.3.1.1 Выбор культуры (изолята) в качестве антигена
Для исследования взяли 10 культур F. necrophorum, выделенных от больных некробактериозом животных с разной клинической формой.
Все культуры F. necrophorum хорошо росли на среде Китта-Тароцци или аминокровин-сывороточном бульоне (АКСБ) при температуре 37ºС. Десять исследуемых культур выделяли газы сероводород и индол, не расщепляли углеводы.
Культура F. necrophorum “ИВ” вызывала агглютинацию взвеси эритроцитов 5%-ой концентрации в разведении 1:32. Культура “Тл” агглютинировала 5%-ую взвесь эритроцитов до разведения 1:16, культуры “Ор1”, “Bn2”, “Эл”, “В” только до разведения 1:4. Слабой агглютинирующей способностью обладали культуры “Н”, “Ор2” до разведения 1:2.
Вирулентные свойства культур F. necrophorum изучали на белых мышах. По данным таблицы 2 можно отметить, что наиболее патогенным для мышей оказалась культура “ИВ” F. necrophorum. На месте инъекции культуры “ИВ” F. necrophorum у всех мышей образовался некроз тканей. Она вызвала гибель всех мышей через 57 дней.
Культура F. necrophorum “Тл”, вызвала образование некроза на месте инъекции у всех животных в опытной группе. Гибель мышей составила 66,7 % через 78 дней в группе.
Таблица 2 – Результаты изучения патогенности культур
F. necrophorum на мышах
| Название культур F. necrophorum | Количество мышей | Время образования некроза (сутки) | Количество павших, гол./% | Время наступления летального исхода (сутки) |
| “Bn2 | 3 | 6 | 1/33,3 | 7 |
| “Н” | 3 | 6 | 0/0 | |
| “ИВ” | 3 | 5 | 3/100 | 57 |
| “Ор1” | 3 | 8 | 0/0 | |
| “Ор2” | 3 | 9 | 0/0 | |
| “Тл” | 3 | 7 | 2/66,7 | 78 |
| “Ол” | 3 | 7 | 1/33,3 | 8 |
| “Эл” | 3 | 7 | 1/33,3 | 7 |
| “Алт” | 3 | 8 | 1/33,3 | 7 |
| “В” | 3 | 7 | 1/33,3 | 7 |
| Контроль | 3 | - | - | - |
Культуры “Bn2”, “Ол”, “Эл”, “Алт”, “В” также вызвали некроз тканей у всех мышей. Гибель животных составила 33,33% в каждой группе. Культуры “Н”, “Ор1”, “Ор2” вызвали некроз тканей на месте инъекции бактериальной взвеси, но все мыши оказались живыми.
В контрольной группе животных на месте инъекции физиологического раствора воспаления не обнаружено, все мыши остались живыми.
Таким образом, по данным реакции гемагглютинации и изучения вирулентных свойств культур F. necrophorum наиболее патогенной для мышей оказалась культура “ИВ”. Культура F. necrophorum “ИВ” выделена из пораженной конечности коровы. Летальная доза (LD50) Fusobacterium necrophorum “ИВ” для мышей составила 9,77 млн. микробных клеток (9,77 · 107м.к.). На основании проведенных исследований для приготовления антигена отобрана культура Fusobacterium necrophorum “ИВ”, которая принята на депонирование Научно-исследовательским институтом Коллекции культур микроорганизмов (НИИ ККМ) Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии “Вектор”.
Принятая культура Fusobacterium necrophorum “ИВ” в НИИ ККМ получила регистрационный номер: B-845 (справка № 0100 от 18 сентября 2000 г.), и определяется нами как штамм Fusobacterium necrophorum ИВ B-845.
Методика приготовления антигена и постановки реакции агглютинации выглядит в следующем виде.
2.2.3.1.2 Методика приготовления антигена F. necrophorum и техника
постановки РА
Культуру выращивали двое суток на среде Китта-Тароцци, затем для получения большого количества бактериальной массы Fusobacterium necrophorum ее пересевали на специальную среду аминокровин-сывороточный бульон (АКСБ). Бактериальные клетки освобождали от среды путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 мин, промывали физиологическим раствором. Для предотвращения самоагглютинации АГ осадок клеток Fusobacterium necrophorum ресуспендировали в фосфатном буфере рН 7,6 до концентрации 10 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту. Исследуемые пробы сыворотки крови животных также разводили в фосфатном буфере.
Антиген инактивировали 0,4%-ым раствором формалина. Стерильность антигена определяли путем посева на среды Китта-Тароцци, МПА, МПБ.
Основные этапы постановки реакции агглютинации следующие: 1. Готовили основное разведение каждой испытуемой сыворотки крови; 2. Готовили рабочие разведения каждой пробы сыворотки; 3. На следующем этапе работы во все пробирки с разведенными сыворотками вносили антиген. Для контроля антигена с целью исключения самоагглютинации в 1 мл фосфатного буфера добавляли 0,1 мл антигена. Штатив с пробирками помещали в термостат при температуре 37°С на 1518 часов, а затем выдерживали при комнатной температуре 23 часа, после чего учитывали реакцию агглютинации визуально и оценивали ее в крестах.
Показатели агглютинации в пробирках на четыре, три или два креста характеризуются как положительная реакция. Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается агглютинация с оценками на два, три или четыре креста, считали ее титром.
2.2.3.2 Изготовление и апробация вакцины ГОА ИЭВСиДВ
2.2.3.2.1 Определение иммунизирующей дозы вакцины.
На основании лабораторных исследований нами разработан регламент изготовления вакцины на основе штамма Fusobacterium necrophorum ИВ B-845, стимулятора резистентности и адъюванта гидроокиси алюминия. Для определения иммунизирующей дозы вакцины сформировали семь групп животных: шесть опытных и одна контрольная, в каждой группе было по 4 коровы. Коровам опытных групп № 1, 3, 5 вакцину вводили однократно, а № 2, 4, 6 дважды с интервалом три недели. Доза вакцины для животных групп № 1 и 2 – 1 мл, № 2 и 4 3 мл, № 5 и 6 5 мл. Животные 7-ой группы (контроль) не были вакцинированы. Титры антител в пробах сыворотки крови животных определяли при помощи разработанной нами реакции агглютинации (табл. 3).
Таким образом, на основании результатов этих исследований в качестве иммунизирующей взята доза вакцины 3 мл, как более экономичная и достаточно иммуногенная.
Таблица 3 – Титры антител сыворотки крови коров, иммунизированных разными дозами вакцины
| Группа, кратность введения | Доза вак-цины | Титры антител (lg) | |||||
| перед опытом | через 14 дней | через1,5 мес. | через 3 мес. | через 5мес. | через 6 мес. | ||
| I/1 | 1 мл | 2,3±0,05 | 2,45±0,04 | 2,5±0,05 | 2,5±0,05 | 2,3±0,03 | 2,3±0,04 |
| II/2 | 1 мл | 2,3±0,06 | 2,5±0,07 | 3,0±0,03* | 2,6±0,08** | 2,45±0,05 | 2,3±0,02 |
| III/1 | 3 мл | 2,3±0,04 | 3,0±0,05* | 3,0±0,04* | 2,8±0,04* | 2,5±0,07 | 2,3±0,02 |
| IV/2 | 3 мл | 2,3±0,04 | 3,0±0,05* | 4,2±0,03* | 3,5±0,04* | 3,0±0,05* | 2,4±0,06 |
| V/1 | 5 мл | 2,4±0,07 | 3,0±0,06* | 3,0±0,05* | 2,9±0,07* | 2,5±0,04 | 2,3±0,08 |
| VI/2 | 5 мл | 2,2±0,04 | 3,1±0,04* | 4,3±0,05* | 3,6±0,04* | 3,0±0,06* | 2,4±0,09 |
| VII (Контроль) | | 2,3±0,04 | 2,3±0,07 | 2,2±0,05 | 2,3±0,06 | 2,2±0,08 | 2,3±0,04 |