Geum.ru

Новые бактериальные патогены в пищевых продуктах: экспериментальное обоснование и разработка системы контроля с применением методов микробиологического и молекулярно-генетического анализа 14. 02. 01 гигиена

Вид материалаАвтореферат
Исследование взаимодействия L.monocytogenes и других эмерджентных патогенов с антагонистически активной микрофлорой пищевых прод
Lactobacillus helveticus
L. monocytogenes
Lactobacillus salivarius
Lactococcus lactis
2.4. Применение общих принципов обеспечения микробиологической безопасности для эффективного контроля L.monocytogenes в пищевых
3. Enterobacter sakazakii – новый вид эмерджентных энтеробактерий в общей системе микробиологической оценки продуктов детского п
E. herbicola
E. sakazakii
Enterobacter sakazakii.
E. sakazakii
Подобный материал:
1   2   3   4   5   6   7

Исследование взаимодействия L.monocytogenes и других эмерджентных патогенов с антагонистически активной микрофлорой пищевых продуктов

Приведенные данные о характере воздействия разнообразных физико-химических и биологических факторов в отношении L.monocytogenes обусловили проведение специальных исследований по изучению способности некоторых микроорганизмов проявлять антагонистические свойства в сложном биоценозе не только с листериями, но и с другими патогенными микроорганизмами – возбудителями эмерджентных пищевых инфекций. Наибольшее значение в этом плане придается молочнокислым бактериям с выраженным антимикробным действием и выделенным из них субстанциям, которые могут использоваться для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта, лечения и профилактики целого ряда заболеваний, что рассматривается в настоящее время как одно из перспективных направлений и в медицине, и в ветеринарии, и в животноводстве.

В связи с этим в 2007-2008 г.г. проведена работа по поиску и отбору антагонистически активных штаммов лактобактерий (LAB). Выделение LAB проводили из продуктов непромышленного производства, для изготовления которых традиционно используются методы микробной ферментации заквасочными культурами, полученными из естественных источников. Всего было исследовано свыше 200 образцов продуктов из 7 областей и регионов, территориально удаленных друг от друга и различающихся по климатическим и экологическим условиям, имеющим местные особенности в структуре питания населения. В процессе работы было выделено и идентифицировано 66 штаммов микроорганизмов, отнесенных к 4 родам молочнокислых бактерий.

Наиболее часто в ферментированных молочных продуктах обнаруживали микроорганизмы рода Lactococcus (50 %). Бактерии родов Leuconostoc и Lactobacillus преимущественно выделяли из сыров и овощных продуктов (100% и 70,6% выделенных штаммов, соответственно).

Анализ таксономической принадлежности исследованных штаммов показал большое разнообразие выделенных видов LAB, включающих представителей практически всех известных филогенетических групп лактобактерий в соответствии с общепринятой классификацией, основанной на комплексной оценке фенотипических свойств и данных 16s rРНК-гомологии [Vandamme P. et al., 1996, Шабанова Н.А. и др., 2009]. Наиболее часто антагонистически активные LAB относились к группе гомоферментативных лактобактерий группы L.delbrueckii – 6 штаммов из 16, 5 штаммов по результатам идентификации были отнесены к факультативно гетеротрофным лактобактериям группы L.casei.

Наибольшую антагонистическую активность проявляли штаммы Lactobacillus helveticus L8 и Lactobacillus curvatus L4 (табл.10). Эти штаммы обладали широким спектром ингибирующего действия практически на все изученные тест-культуры патогенных микроорганизмов. Наиболее выражен был антагонизм L. helveticus и L. curvatus в отношении патогенных L.monocytogenes. Достаточно высокий уровень активности был также отмечен у штамма L.fermentii (L1/1), выделенного из творога, произведенного в Ростовской области. Антимикробное действие данного штамма проявлялось в отношении L.monocytogenes, Salmonella, E.sakazakii.

Таблица 10

Антагонистическая активность выделенных штаммов LAB

Исследованные штаммы LAB
Тест - культуры (диаметр зон задержки роста, мм, n =4)

L. monocytogenes 766
Salmonella typhimurium
E.coli O157:H7
E.coli

M-17
Enterobacter sakazakii

Lactobacillus fermentii L1/1
11,0 + 0,5
9.5 + 0,2
0
9.5 + 0,3
10.0 + 0,5

Lactococcus lactis L14

-
-
10.5 + 0,5
21.0 + 1,0
-

Lactobacillus curvatus L4
16.5 + 2,0
-
11,0+ 0,5
15,2+ 0,4
10,8 + 0,6

Lactobacillus helveticus L8
13,6 + 1,2
10,3 + 0,75
11,75 + 0,8
9.5 + 0,5
9.5 + 0,3

Lactobacillus acidophilus L5
-
н/д**
н/д
18,0 + 2,0
-

Lactobacillus salivarius L17
н/д
н/д
-
10,0 + 0,5
14,0+ 0,6

Lactococcus lactis A 5.11
12,0 + 0,45
-
-
-
11.5 + 0,2

* - « - » - зоны задержки роста отсутствуют; ** - н/д – нет данных

С целью изучения способности культур LAB к синтезу антибактериальных веществ проведены исследования по оптимизации условий культивирования штаммов-продуцентов. По результатам оценки ростовых характеристик и рецептур различных питательных субстратов были составлены 4 варианта модифицированных сред, в которых варьировали ростовые факторы (в т.ч. триптон, углеводы, олигосахариды, микронутриенты). В качестве основы использовали стандартную рецептуру MRS-бульона. Эффективность исследуемых композиций сред культивирования оценивали по скорости накопления биомассы клеток LAB и уровню их антагонистической активности по отношению к патогенным тест – микроорганизмам. Результаты оценки ростовых и функциональных свойств испытанных субстратов приведены на рис. 8.

Проведенные исследования показали возможность улучшения условий культивирования LAB – продуцентов антимикробных субстанций при добавлении в состав MRS- бульона стимуляторов роста лактобактерий (дрожжевой экстракт, глюкоза, лактоза), а также при использовании соевого пептона в сочетании с инулином, моно- и дисахарами. Испытанные варианты сред могут быть использованы для получения антагонистически активных бактериальных препаратов или антимикробных субстанций LAB.



Рис.8. Функциональные свойства модифицированных сред (% прироста биомассы штаммов LAB)


В результате экспериментальных исследований отработана модель совместного культивирования молочнокислых микроорганизмов и эмерджентных патогенов. Отобрано 5 штаммов с наиболее выраженным антагонистическим потенциалом в отношении L.monocytogenes, которые могут быть рекомендованы для промышленного использования в составе бактериальных заквасок в производстве ферментированных и новых видов пищевых продуктов, а также микробных ассоциаций с направленным антилистериозным действием.


2.4. Применение общих принципов обеспечения микробиологической безопасности для эффективного контроля L.monocytogenes в пищевых продуктах

Результаты изучения свойств и распространенности L.monocytogenes, эпидемиологии листериозных заболеваний возбудителя постоянно систематизируются, обобщаются и используются гигиенистами в различных странах мира для разработки национальных программ и организационных мероприятий, направленных на производство и потребление безопасных пищевых продуктов. Принято считать, что анализ риска для одного из наиболее опасных эмерджентных возбудителей пищевых инфекций L.monocytogenes практически завершен, однако решение практических задач по внедрению программ HACCP в системы контроля предприятий отечественной пищевой индустрии остается чрезвычайно актуальным. Использование универсальной структурной модели АМР (анализ микробиологического риска) обеспечивает более целостный подход к безопасности пищи путем интеграции рисков по всей пищевой цепи, направлено на уменьшение количества связанных с ней инфекций, и способствует гармонизации национальных и международных стандартов, норм и санитарных правил.

Актуальность проблемы в условиях современной пищевой индустрии, переработки и хранения продукции, благоприятствующих выживанию листерий в пище, чрезвычайно обострилась. Она в первую очередь связана со способностью микроорганизма при пищевом пути передачи вызывать тяжелую, часто смертельную инфекцию у людей всех возрастов, его возрастающей ролью в перинатальной и неонатальной смертности. А во-вторых, обусловлена биологическими свойствами Listeria monocytogenes – психротрофных, факультативно-анаэробных и галотолерантных микроорганизмов, способности размножаться при холодильном хранении продуктов и в современных видах упаковки, ограничивающей доступ кислорода. Пять ключевых факторов определены как наиболее значимые, с которыми связан наибольший риск возникновения пищевого листериоза, а именно:
  • Количество и частота употребления продукта
  • Частота и уровень контаминации продукта бактериями L.monocytogenes
  • Способность продукта поддерживать рост L.monocytogenes
  • Температура замораживания/охлаждения продукта при хранении
  • Продолжительность хранения замороженного/охлажденного продукта

Комбинация этих категорий для оценки риска листериоза более эффективна, нежели определение влияния каждого фактора по отдельности. В дополнение к перечисленным ключевым моментам, влияющим на количество L.monocytogenes в продукте на момент его употребления, выделяется еще один значимый признак – индивидуальная восприимчивость потребителя к данному патогену.

Необходимость создания в нашей стране свода правил, предупреждающих возможность пищевого листериоза, анализ изученности этой проблемы за рубежом, материалов международных организаций, собственные экспериментальные данные и методические проработки позволили впервые в системе санитарно-эпидемиологического нормирования в России обосновать и ввести в действие новый гигиенический норматив безопасности по показателю Listeria monocytogenes: «Гигиенический норматив ГН 2.3.2.1010-01 (дополнение к СанПиН 2.3.2.560-96) – микробиологический норматив безопасности: “Listeria monocytogenes в 25 г продукта не допускается».

Этот показатель конкретизирован с учетом результатов собственных экспериментальных исследований и сформулирован в виде дифференцированных нормативов для наиболее значимых групп пищевой продукции в Санитарных правилах и нормативах 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов». В разработанном документе отражены также специальные (более жесткие) требования к продуктам, предназначенным для наиболее уязвимых групп населения по степени риска заболеваемости листериозом, в том числе детей раннего возраста, беременных и кормящих женщин, больных и ослабленных людей.


3. Enterobacter sakazakii – новый вид эмерджентных энтеробактерий в общей системе микробиологической оценки продуктов детского питания

Обширная группа колиформных бактерий, традиционно используемая в пищевой микробиологии в качестве санитарно-показательных микроорганизмов – индикаторов фекального загрязнения, в последние десятилетия все чаще становится объектом изучения этиологии новых и вновь возникающих пищевых инфекций, вызываемых измененными вариантами отдельных видов семейства Enterobacteriaceae.

Одним из наиболее наглядных примеров появления таких эмерджентных патогенов среди хорошо изученных популяций непатогенных и условно патогенных энтеробактерий является обнаружение среди бактерий Enterobacter cloacae нового вида Enterobacter sakazaki – возбудителя эмерджентных инфекций у новорожденных и детей раннего возраста. Названный в честь японского микробиолога Riichi Sakazaki, впервые выделившего этот микроорганизм, E.sakazakii в настоящее время интенсивно исследуется в различных странах мира [Gurtler J.B. et al., 2005, Iversen C. et al., 2008, Johler S. et al., 2009].

C целью выявления возможной контаминации сухих инстантных молочных смесей новыми видами патогенов проведены исследования по обнаружению E. sakazakii при санитарно - микробиологическом контроле продуктов детского питания. С применением метода количественного подсчета и расширенной биохимической идентификации в образцах детских сухих молочных смесей впервые в РФ были обнаружены эмерджентные патогенные бактерии E.sakazakii в количестве 0,04 - 0,4 КОЕ/г. Следует подчеркнуть, что E. sakazakii были выделены также при анализе 100 г продукта при использовании селективных сред для патогенных энтеробактерий. Интересен факт выявления этих микроорганизмов в ассоциации с Acinetobacter baumannii/calcoaceticus, которые достаточно часто обнаруживаются в клинических материалах, в смывах в отделениях интенсивной терапии, и считаются возбудителями некоторых нозокомиальных инфекций.

Проведенные исследования показали необходимость оценить диагностическую значимость традиционно используемых тестов идентификации и разработать схему, пригодную для дифференциации E.sakasakii от фенотипически близких вариантов энтеробактерий. Идентификация E. sakazakii вызывает значительные затруднения в связи с идентичностью этого вида по большинству культурально-биохимических признаков с другим представителем рода – E. cloacae. Основной дифференцирующий признак двух видов энтеробактеров - способность E. sakazakii к образованию желтого пигмента также является характерным для бактерий Erwinia herbicola, которые не относятся к колиформным, но достаточно часто обнаруживаются при анализе на БГКП в сухих детских продуктах, содержащих наряду с молочной основой компоненты растительного происхождения [Карликанова Н.Р. и др., 1991]. Известно, что E.herbicola, являясь одним из представителей микробиоты растительных экосистем, считается видом непатогенным для человека, однако имеющиеся литературные данные свидетельствуют о наличии у них фитопатогенных свойств, механизм регуляции которых недостаточно изучен.

Бактерии E. herbicola по своим таксономическим признакам относятся к микроорганизмам, роль и место которых в семействе Enterobacteriaceae многократно менялись: вначале E. herbicola отождествлялись с Enterobacter agglomerans; позднее, Erwinia выделяется как один из родов семейства (E. herbicola является одним из 13 входящих в него видов), а E. agglomerans признается отдельным видом в составе рода Enterobacter. В современной систематике бактерий E. herbicola и E. agglomerans вновь объединены в один вид под названием Pantoea agglomerans и переведены в род Pantoea. Данный представитель семейства энтеробактерий наряду со способностью к пигментообразованию обладает значительным числом одинаковых с E. sakazakii и E. cloacae биохимических и генетических признаков. Следует отметить, что в последние годы P. agglomerans неоднократно регистрировались как возбудители оппортунистических инфекций – ожоговых, раневых, мочевыводящих путей.

Биохимические свойства, наиболее четко дифференцирующие E. sakazakii от близкородственных представителей энтеробактерий Enterobacter cloacae и Pantoea agglomerans, приведены в табл.11. Выделенные из детских сухих инстантных смесей культуры энтеробактерий, соответствующие комплексу признаков, указанных в таблице, имеющие желтый пигмент, не ферментирующие сорбит и не разжижающие желатину, с высокой степенью вероятности могут быть отнесены к Enterobacter sakazakii.

Таблица 11.

Биохимическая дифференциация Enterobacter sakazakii.

Тест или субстрат
Реакции

E. sakazakii
E. cloacae
P. agglomerans

Лизиндекарбоксилаза
-
-
-

Аргининдегидролаза
+
+
-

Орнитиндекарбоксилаза
+
+
(-)

Подвижность
+
+
(+)

Утилизация цитратов
+
+
+

Реакция с метиловым красным
-
-
-

Реакция Фогес–Проскауэра
+
+
(+)

Индол
-
-
(-)

Глюкоза
+
+
+

Лактоза
+
+
(+)

Сахароза
+
+
(+)

Дульцит
-
-
(-)

Адонит
-
(-)
-

Раффиноза
(+)
+
(+)

D-cорбит
-
+
(+)

α-метил-D-глюкозид
+
(+)
-

мальтоза
+
+
+

Маннит
+
+
+

Разжижение желатины (22ОС)
-
-
+

Мукоидный рост
+
+
+

Желтый пигмент при 24оС
+
-
(+)