Методические указания к лабораторным работам и вопросы для самостоятельной подготовки студентов 2-го курса эколого-биологического факультета

Вид материала

Методические указания

Содержание Техника безопасности Работа 3. выделение белков из тканей Ход работы Ход работы Второй этап. Ход работы. Вывод (написать уравнение гидролиза белков) Радиальная (круговая) хроматография Ход работы Нисходящая хроматография Ход работы Работа 4. растворимость и реакции осаждения белков Ход работы 2. Реакции осаждения белков 1. Осаждение белков неорганическими осадителями

Подобный материал:

• Методические указания к электронным лабораторным работам по курсу физической химии, 2388.82kb.
• Методические указания к лабораторным работам по курсу "Математическое моделирование, 921.14kb.
• Методические указания к лабораторным работам по биологической химии для студентов, 948.06kb.
• Методические указания к лабораторным работам Самара 2007, 863.04kb.
• Методические указания к лабораторным работам для студентов специальности 210100 "Автоматика, 536.56kb.
• Методические указания к лабораторным работам №1-­5 для студентов специальности 210100, 363.6kb.
• Методические указания по лабораторным работам Факультет: электроэнергетический, 554.73kb.
• Методические указания к лабораторным работам по курсу, 438.32kb.
• Методические указания к лабораторным занятиям и самостоятельной работе студентов, 490.78kb.
• Методические указания к лабораторным работам по физике по практикуму «Вычислительная, 138.12kb.

Техника безопасности

• Категорически запрещается отмеривать концентрированные кислоты и щелочи обыкновенными пипетками – для отмеривания реактивов использовать мерные пробирки.
  
• Будьте внимательны при наливании концентрированных кислот и щелочей.
  
• В процессе нагревания постоянно перемешивайте жидкость, не допускайте выброса ее из пробирки.
  
• Соблюдайте правила пожарной безопасности.
  

РАБОТА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ИЗ ТКАНЕЙ

И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ. ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА протеинов

Цель работы: ознакомиться с основными этапами изучения состава простых и сложных белков (гомогенизация биомате-риала, экстракция белков, гидролиз и разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматогра-фии.

Задачи:

• выделить белки из мышечной ткани и яичного альбумина;
  
• провести кислотный гидролиз яичного альбумина;
  
• разделить предложенную смесь аминокислот методом распредели-тельной хроматографии, определить, какие аминокислоты входят в ее состав.
  

1. Основные этапы изучения состава протеинов

Первый этап. Выделение белков из биоматериала

а) Выделение белков из мышечной ткани

Принцип метода. Миофибриллы мышечной клетки содержат сократительные белки (миозин и актин) и регуляторные белки (тропомиозин и тропонин). Белки миофибрилл не растворяются в воде, но их можно экстрагировать из мышечной ткани солевыми растворами с концентрацией соли 0,5 моль/л. Многие белки саркоплазмы (гиалоплазмы мышечных клеток) растворимы в воде или солевых растворах низкой концентрации (0,05 моль/л). При экстракции мышечной ткани 5%-м раствором хлорида калия извлекаются как миофибриллярные, так и саркоплазматические белки.

Ход работы

1. Взвешивают 2 г мышечной ткани. Измельченную ножницами навеску помещают в фарфоровую ступку, добавляют 2 мл 5%-го раствора хлорида калия и растирают со стеклянным песком до гомогенного состояния. К гомогенату добавляют 3 мл раствора хлорида калия и растирают кашицу в течение 5 минут, после чего прибавляют еще 5 мл 5%-го раствора хлорида калия и продолжают растирание в течение 5 минут.

2. Полученный гомогенат фильтруют через два слоя марли или центрифугируют в течение 15 минут при 4000 об/мин.

3. С фильтратом (или центрифугатом) проделывают цветные реакции на белки (биуретовую, ксантопротеиновую, реакции Милона, Фоля и Сакагучи).


б) Выделение яичного альбумина

Принцип метода. Яичный белок представляет собой смесь нескольких белков. Примерно 70% яичного белка составляет альбумин, который легко отделяется от глобулинов. При десятикратном разведении яичного белка дистиллированной водой глобулины выпадают в осадок, а альбумин остается в растворе.

Ход работы

1. Чтобы отделить белок от желтка, осторожно проделывают отверстия в скорлупе яйца с двух концов и выливают белок в стакан емкостью 500 мл, затем в стакан добавляют 250 мл дистиллированной воды и содержимое тщательно перемешивают стеклянной палочкой с резиновым наконечником.

2. Раствор переносят в мерный цилиндр и объем доводят дистиллированной водой до 300 мл. Раствор оставляют на 30 минут при комнатной температуре для образования хлопьевидного осадка глобулинов.

Примечание: работу, описанную в пунктах 1 и 2, выполняет и демонстрирует дежурный студент, приготовленную суспензию затем использует каждый студент в группе.

3. 20 мл полученной суспензии дважды фильтруют через складчатый фильтр.
   
4. С фильтратом, содержащим яичный альбумин, проделывают цветные реакции на белки (биуретовую, нингидриновую, ксантопротеиновую, реакции Милона, Фоля).
   

Второй этап. Кислотный гидролиз белков

Принцип метода. В процессе гидролиза белков происходит разрыв пептидных связей и молекула белка поэтапно распадается на высокомолекулярные полипептиды, более простые пептиды и, наконец, на аминокислоты. Кислотный гидролиз белков проводят в присутствии соляной или серной кислот при кипячении.

Гидролиз, проводимый в лабораторных условиях, является важным методом изучения первичной структуры белка. В организме гидролиз постоянно протекает в процессе пищеварения и в тканях под действием протеолитических ферментов.

Ход работы. В небольшую колбочку, снабженную обратным холодильником, наливают 2-3 мл 2%-го раствора альбумина и 15-20 мл 25%-го раствора серной кислоты. Содержимое колбы кипятят под тягой в течение 60-90 минут. Через каждые полчаса (с момента закипания) с гидролизатом проделывают биуретовую реакцию, для этого к 0,5 мл гидролизата добавляют 30%-й раствор щелочи до нейтральной реакции по универсальной индикаторной бумаге и 1-2 капли 1%-го раствора сульфата меди. Отрицательная биуретовая реакция указывает на полное расщепление белка до аминокислот.

Для сравнения биуретовую реакцию делают с 2%-м раствором альбумина.

Вывод (написать уравнение гидролиза белков):


Третий этап. Разделение смеси аминокислот методом

распределительной хроматографии на бумаге

Принцип метода. Метод основан на различной растворимости аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях: воде и органическом растворителе. Водная фаза неподвижна, так как вода сорбирована на инертном носителе  целлюлозе, которая в насыщенной влагой атмосфере (хроматографической камере) удерживает до 20-22% воды. Подвижной фазой является насыщенный водой органический растворитель. Чем больше растворимость аминокислот в воде и меньше в органическом растворителе, тем медленнее движется аминокислота на бумаге.

Положение аминокислот на бумаге можно определить с помощью нингидриновой реакции: в присутствии нингидрина отдельные аминокислоты выявляются в виде окрашенных пятен.

Показателем скорости движения аминокислоты является коэффициент распределения (R_f). Коэффициентом распределения называется отношение расстояния (в миллиметрах) от места нанесения аминокислоты (точка старта) до середины ее пятна (а) к расстоянию от точки старта до фронта растворителя (в): R_f = а/в. Коэффициент распределения является характерной величиной для каждой амино-кислоты и постоянен при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги и др.).

Идентификация аминокислот на хроматограммах проводится путем сравнения R_f разделяемых и известных аминокислот (стандартов).

Существуют различные способы хроматографического разделения смеси аминокислот на бумаге.

Радиальная (круговая) хроматография

Для разделения смеси аминокислот используется растворитель, состоящий из смеси н-бутанола, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5. Приготовленная смесь встряхивается в делительной воронке в течение 5 минут, а затем отстаивается 7-10 часов, после чего нижний слой используется для насыщения хроматографической камеры парами, а верхний  для разделения аминокислот. Хроматографической камерой служит эксикатор.

Ход работы

1. Хроматографическую бумагу вырезают в форме диска, диаметр которого соответствует внутреннему диаметру эксикатора. В центр диска (на точку старта) наносят микропипеткой в несколько приемов 0,005-0,01 мл исследуемой смеси аминокислот. Нанесение смеси следует проводить очень аккуратно, слегка касаясь микропипеткой стартовой точки, чтобы диаметр мокрого пятна был не более 5 мм. После каждого нанесения пятно подсушивают над электроплиткой или в термостате.
   
2. В центре хроматограмм делают иглой отверстие, в которое пропускают фитилек из сложенной вчетверо х/б нити. Хроматограмму помещают в эксикатор, на дно которого предварительно наливают верхний слой растворителя. Проверяют положение фитилька и хроматограммы: конец фитилька должен быть погружен в растворитель, а края хроматограммы должны находиться на выступах эксикатора. Закрывают эксикатор крышкой.
   
3. Растворитель поднимается вверх по фитильку, а затем радиально распространяется по бумаге от центра. Когда растворитель достигнет края бумаги, ее вынимают из эксикатора, высушивают под тягой, обрабатывают 0,5%-м раствором нингидрина (готовится на ацетоне или спирте) и помещают в сушильный шкаф при 60-70 ^оС на 10-15 минут. На хроматограмме появляются сине-фиолетовые пятна, каждое из которых соответствует отдельной аминокислоте.
   

Нисходящая хроматография

В качестве хроматографической камеры используют высокие стеклянные банки с выступом в верхней части. На выступ в строго горизонтальном положении ставят лодочку – специальный стеклянный сосуд для растворителя.


Ход работы

1. Из хроматографической бумаги вырезают полоску шириной 5 см и длиной, примерно соответствующей высоте камеры. На расстоянии 10 см от конца полоски проводят простым карандашом стартовую линию, в середине которой отмечают точку старта. На стартовую точку микропипеткой наносят 0,005-0,01 мл смеси аминокислот (в несколько приемов, диаметр мокрого пятна не более 5 мм), периодически просушивая бумагу над электрической плиткой (или над настольной лампой).
   
2. На дно хроматографической камеры наливают небольшое количество нижнего слоя растворителя, а в установленную лодочку – верхний слой растворителя. Хроматограмму с нанесенной смесью аминокислот помещают в камеру так, чтобы ближний к старту конец был опущен в лодочку и зафиксирован в ней предметным стеклом, а другой висел вертикально, не касаясь стенок камеры. Камеру закрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре на 18-20 часов.
   
3. Растворитель продвигается по хроматограмме сверху вниз, и когда фронт его приблизится к нижнему краю бумаги, хроматограмму вынимают из камеры и высушивают под тягой. Затем ее обрабатывают 0,5%-м раствором нингидрина и помещают в сушильный шкаф при 60-70 ^оС на 10-15 минут для развития окраски, после чего на ней появляются пятна сине-фиолетового или лилового цвета, соответ-ствующие аминокислотам.
   

Результаты:


Выводы:


2.2. изучение некоторых свойств белков


РАБОТА 4. РАСТВОРИМОСТЬ И РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ

Цель работы: изучение важного свойства белков  способности к растворению и реакциям осаждения.

Задачи:

• выделить основные две фракции из яичного белка и доказать, что альбумин, входящий в его состав, хорошо растворяется в дистил-лированной воде, а глобулин  в растворе солей;
  
• провести предложенные реакции необратимого осаждения белков;
  
• с помощью реакций высаливания разделить белки плазмы крови на основные фракции (фибриноген, альбумины и глобулины);
  
• доказать, что высаливание  обратимый процесс, при котором сохраняются свойства нативного белка, а денатурация  необратимый;
  
• проанализировать полученные результаты и сделать выводы.
  

1. Растворимость белков

Многие белки растворяются в воде, что обусловлено наличием на поверхности белковой молекулы свободных гидрофильных групп. Растворимость белка в воде зависит от структуры белка, реакции среды, присутствия электролитов. В кислой среде лучше растворяются белки, для которых характерны кислотные свойства, а в щелочной  белки, обладающие основными свойствами. Альбумины хорошо растворяются в дистиллированной воде, а глобулины растворимы в воде только в присутствии электролитов. Не растворяются в воде белки опорных тканей (коллаген, кератин, эластин и др.).

Ход работы

1. К 2 каплям неразведенного яичного белка прибавляют 1 мл дистиллированной воды и перемешивают. При этом яичный альбумин растворяется, а яичный глобулин выпадает в виде небольшого осадка.

2. К 2 каплям яичного белка прибавляют 1 мл 5%-го раствора хлорида калия. В слабом солевом растворе растворяются как альбумины, так и глобулины.

3. Проверяют растворимость в воде и 5%-м растворе хлористого калия белка кератина, содержащегося в шерсти и волосах.


2. Реакции осаждения белков

Реакции осаждения белков могут быть необратимыми и обратимыми.

А. Необратимое осаждение белков (денатурация)

Принцип метода. Необратимые реакции осаждения приводят к денатурации белков, при этом разрушается пространственная структура молекулы и белки утрачивают свои естественные биоло-гические и физико-химические свойства. Денатурацию белков можно вызвать физическими воздействиями (кипячение, замораживание, высокое давление, вибрация, радиоактивное излучение и др.) и химическими осадителями.


1. Осаждение белков неорганическими осадителями

Осаждение беков минеральными кислотами

Ход работы. В пробирку осторожно наливают около 1 мл концент-рированной азотной кислоты. Затем, наклонив пробирку, медленно по стенке добавляют 1 мл 1%-го раствора белка. На границе двух жидкос-тей появляется осадок в виде белого кольца.

Такую же реакцию проделывают с концентрированной соляной и серной кислотами.