Исследования по разработке и стандартизации лекарственных растительных средств для профилактики и комплексного лечения заболеваний органов пищеварения 15. 00. 02 фармацевтическая химия, фармакогнозия
| Вид материала | Автореферат |
- Разработка и стандартизация комплексного растительного средства, рекомендуемого для, 484.67kb.
- Исследование по стандартизации и разработке лекарственных средств на основе листьев, 475.51kb.
- Исследования по разработке и стандартизации комбинированного антимикробного и регенерирующего, 405.42kb.
- Кафедра фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета Фармацевтическая, 361.13kb.
- «Фармацевтическая химия» специальность – 111201 Ветеринарный врач специализация Ветеринарная, 77.44kb.
- Синтез, свойства и биологическая активность енаминоамидов ацилпировиноградных кислот, 439.81kb.
- Примерная программа рекомендуется для направления подготовки (специальности) 111801, 717.4kb.
- Синтез соединений на основе химических превращений производных α- оксокарбоновых кислот, 643.93kb.
- Предназначено для лечения и профилактики заболеваний в лечебных и лечебно-профилактических, 82.16kb.
- Синтез, свойства, биологическая активность n-гетериламидов α-оксокислот и продуктов, 367.21kb.
26
27
28
29
30
32
31
34
33
Рис. 2. Хроматограмма спиртового извлечения сбора №1
В сборе №2 (рис.3) установлено присутствие 24 веществ фенольной природы, из которых 5 идентифицированы как флавоноиды (рутин (10), кверцетин (17), изокверцетин (12), лютеолин-7-глюкозид (11), апигенин (24)) и 3, как оксикоричные кислоты (галловая (4), хлорогеновая (8) и кофейная (9)).
Рис.3. Хроматограмма спиртового извлечения сбора №2
В сборе №3 (рис.4) - 25 веществ фенольной природы, из которых 8 идентифицированы как флавоноиды (рутин (9), кверцетин (18), изокверцетин (11), авикулярин (14), гиперозид (20), лютеолин-7-глюкозид (10), ликуразид (23), апигенин (25)) и 3, как оксикоричные кислоты (галловая (4), хлорогеновая (6), кофейная (8))
.
Рис. 4. Хроматограмма спиртового извлечения сбора №3
В сборе №4 (рис.5) - 29 веществ фенольной природы, из которых 7 идентифицированы как флавоноиды (рутин (9), кверцетин (19), изокверцетин (11), гесперидин (17), лютеолин-7-глюкозид (11), гиперозид (21), апигенин (23)) и 3, как оксикоричные кислоты (галловая (5), хлорогеновая (7) и кофейная (8)).
Рис.5. Хроматограмма спиртового извлечения сбора №4
Количественное содержание идентифицированных компонентов рассчитывали по площади пиков. По рутину и кверцетину строили дополнительно градуировочные графики и также определяли их процентное содержание в сборах, чтобы выявить флавоноиды, доминирующие в сумме, на которые в дальнейшем будем вести пересчет при стандартизации сборов. Анализируя полученные результаты, было установлено, что доминирующим в количественном отношении в сумме флавоноидов сборов №1 - №4 является рутин.
Количественный анализ сборов
Согласно литературным данным, химический состав растений, входящих в состав сборов, изучен достаточно подробно, но поскольку мы предлагаем новые композиции из этих растений, для нас представляло интерес определить количественное содержание основных групп БАВ, чтобы среди них выбрать приоритетные маркеры, по которым в дальнейшем проводить стандартизацию.
Нами проведено количественное определение содержания различных групп БАВ по модифицированным методикам (табл.2).
Таблица 2
Содержание БАВ в сборах
| Группа БАВ | Числовые показатели, % | |||
| Сбор №1 | Сбор №2 | Сбор №3 | Сбор №4 | |
| Аскорбиновая кислота | 3,55±0,07 | 6,26±0,14 | 5,08±0,10 | 4,31±0,14 |
| Органические кислоты | 0,37±0,01 | 0,50±0,02 | 0,45±0,02 | 1,07±0,04 |
| Каротиноиды (в пересчете на β-каротин) | 0,021±0,001 | 0,063±0,003 | 0,041±0,002 | 0,035±0,001 |
| Эфирные масла | 0,728±0,023 | 0,437±0,010 | 0,956±0,025 | 1,140±0,025 |
| Содержание алантолактона | | 1,03±0,03 | 1,40±0,04 | 2,03±0,05 |
| Сапонины (в пересчете на олеаноловую кислоту) | 1,37±0,03 | 1,20±0,04 | 1,45±0,03 | 1,18±0,03 |
| Фенолкарбоновые кислоты (в пересчете на хлорогеновую) | 1,85±0,08 | 1,06±0,03 | 1,75±0,06 | 1,24±0,05 |
| Кумарины | 0,40±0,02 | 0,27±0,01 | 0,45±0,02 | 0,31±0,01 |
| Антраценпроизводные (в пересчете на истизин) | - | - | - | 0,95 ± 0,02 |
Установлен качественный и количественный аминокислотный состав сборов на аминокислотном анализаторе ААА-339 (ЧССР) (табл. 3). Полученные данные позволили установить присутствие 14 аминокислот, из которых восемь незаменимых, шесть заменимых и среди них преобладают аминокислоты – пролин, глицин, валин, цистеин и аргинин.
Таблица 3
Содержание свободных аминокислот в сборах
| Аминокислоты | Содержание аминокислот в сборах, % | |||
| Сбор №1 | Сбор №2 | Сбор №3 | Сбор №4 | |
| Лизин* | 0,33±0,01 | 0,112±0,004 | 0,21±0,01 | 0,26±0,01 |
| Метионин* | 0,110±0,005 | 0,160±0,006 | 0,13±0,005 | 0,133±0,002 |
| Цистеин | 0,63±0,03 | 0,60±0,01 | 0,53±0,02 | 0,54±0,02 |
| Гистидин* | 0,102±0,004 | 0,073±0,001 | 0,081±0,001 | 0,094±0,003 |
| Аргинин | 0,55±0,02 | 0,71±0,02 | 0,51±0,02 | 0,51±0,02 |
| Треонин* | 0,28±0,01 | 0,37±0,01 | 0,31±0,01 | 0,28±0,01 |
| Серин | 0,44±0,02 | 0,55±0,01 | 0,48±0,01 | 0,41±0,01 |
| Пролин | 1,41±0,06 | 1,60±0,08 | 1,40±0,05 | 1,29±0,05 |
| Глицин | 0,86±0,04 | 0,93±0,05 | 0,96±0,03 | 0,85±0,01 |
| Валин* | 0,63±0,03 | 0,73±0,03 | 1,16±0,04 | 0,83±0,02 |
| Изолейцин* | 0,36±0,01 | 0,28±0,01 | 0,19±0,04 | 0,27±0,01 |
| Лейцин* | 0,180±0,008 | 0,024±0,001 | 0,091±0,004 | 0,160±0,008 |
| Тирозин | 0,170±0,005 | 0,22±0,01 | 0,34±0,01 | 0,21±0,01 |
| Фенилаланин* | 0,31±0,01 | 0,45±0,02 | 0,37±0,01 | 0,32±0,01 |
| Суммарное содержание | 6,36±0,14 | 6,80±0,22 | 6,76±0,18 | 6,15±0,15 |
| Примечание: * - незаменимые аминокислоты | ||||
Методом атомно-абсорбционной спектрометрии проведено определение макро- и микроэлементов в растительных сборах, поскольку они играют важную роль в формировании тканей организма, пластических процессах, проявляют фармакологическую активность, влияют на обмен веществ, активизируют ферментные системы, потенцируют действие витаминов (табл.4).
Таблица 4
Элементный состав сборов
| Наименование элементов | Количественное содержание элементов | ||||||
| Сбор №1 | Сбор №2 | Сбор №3 | Сбор №4 | ||||
| Макроэлементы, % | |||||||
| Калий | 1,30±0,05 | 1,20±0,03 | 1,38±0,06 | 1,14±0,03 | |||
| Натрий | 0,191±0,008 | 0,21±0,01 | 0,24±0,01 | 0,20±0,01 | |||
| Кальций | 1,26±0,04 | 1,17±0,03 | 1,12±0,04 | 1,29±0,05 | |||
| Фосфор | 0,21±0,01 | 0,26±0,01 | 0,21±0,01 | 0,182±0,006 | |||
| Микроэлементы, мг/кг | |||||||
| Цинк | 78,48±2,14 | 96,80±4,05 | 129,90±4,11 | 76,31±3,15 | |||
| Железо | 233,74±5,14 | 309,56±7,18 | 798,06±9,14 | 298,34±6,24 | |||
| Медь | 2,40±0,11 | 1,54±0,05 | 2,20±0,05 | 2,38±0,08 | |||
| Марганец | 534,70±11,65 | 543,71±10,14 | 620,76±15,10 | 526,36±12,47 | |||
| Иод | 0,150±0,006 | 0,18±0,01 | 0,22±0,01 | 0,161±0,008 | |||
В сборах не были обнаружены свинец, ртуть, алюминий, кадмий, что характеризует экологическую чистоту лекарственного растительного сырья, входящего в состав сборов. В тоже время, наличие и относительно высокое содержание некоторых макро- (K, Na, Ca, P) и микроэлементов (Zn, Fe, Mn, Cu, J), расширяет диапазон применения сборов и область рекомендуемых заболеваний для их профилактического и лечебного использования.
Эфирные масла из сборов были получены методом перегонки с водяным паром с подбором оптимальных условий количественного определения. Установлено, что максимальный выход эфирных масел наблюдался при использовании: навески 30,0 г для сборов №1 и №3; 25,0 г – для сборов №2 №4; измельченности сырья 2 мм для сбора №2 и 3 мм для сборов №1, № 3 и №4; время перегонки 2 часа для всех сборов. Полученные эфирные масла были подвергнуты качественному анализу хромато-масс-спектрометрическим методом.Идентификацию компонентов проводили по масс-спектрам электронного удара, фиксируя следующие показатели: названия соединений; времена удерживания; величины количественного вклада в смесь; индекс сходства (Match qulity) библиотечного и полученного спектров, а также учитывая аналитические параметры компонентов эфирных масел (И.Г.Зенкевич,1997) для идентификации моно- и сесквитерпеновых углеводородов. При этом, индекс сходства с величиной более 90% свидетельствовал об очень хорошем совпадении. В остальных случаях обращали внимание на такие показатели, как коэффициент тождественности, различие «идеального совпадения» и коэффициента тождественности, меру чистоты спектра, коэффициент загрязненности, величину надежности, взаимную корреляцию. Опираясь на наилучшие значения вышеперечисленных показателей и, учитывая результаты масс-спектрометрического изучения процессов диссоциации сесквитерпенов, нам удалось однозначно идентифицировать компонентный состав эфирных масел, выделенных из сборов №1 - №4. Хроматограммы могут служить дополнительной характеристикой подлинности сборов.
Анализируя результаты изучения компонентного состава эфирного масла сбора №1 (рис.6) можно отметить, что среди 28 веществ, относящихся к монотерпеновым и сесквитерпеновым углеводородам, в максимальном количестве накапливаются α-мууролен (17,99%), 6,10,14-триметил-2-пентадеканон (10,96%), α-кадинол (8,99%), производные азулена (4,42%), эудесма-5,11(13)-диен-8,12-олид (3,59%), п-Мент-1(7)-ен-9-ол (3,23%), ледол (2,33%), и в меньшем количестве: кариофиллен оксид (1,61%), 9,10-дегидро-изолонгифолен (1,09%), спатуленол и α-бисаболол.
Рис.6 Хроматограмма компонентного состава эфирного масла сбора №1
В результате исследования эфирного масла из сбора №2 (рис.7) обнаружено 14 веществ, относящихся к монотерпеновым и сесквитерпеновым углеводородам, среди которых преобладают эудесма-5,11(13)-диен-8,12-олид (27,27%), α-мууролен (17,04%), производные нафтофурана (17,9%), α-кадинол (7,51%), производные пентанола (4,73% и 5,25%), изоборнилацетат (1,96%).
Рис.7 Хроматограмма компонентного состава эфирного масла сбора №2
Анализируя полученные результаты представленные на рисунке 8 можно отметить, что в эфирном масле сбора №3 обнаружено 36 веществ монотерпеновой и сесквитерпеновой природы. В максимальном количестве накапливаются п-аллил-анизол (29,53%), эудесма-5,11(13)-диен-8,12-олид (18,54%), производные нафтофурана (15,46%), α-мууролен (7,08%), циклогексена (5,31%), санталол (2,42%), α-кадинол (1,86%), спатуленол (1,41%), в меньшем количестве: эвкалиптол, α-калакорен, кариофиллен оксид, ледол, α-бисаболол, изолонгифолен, D-лимонен, ментол.
Рис.8 Хроматограмма компонентного состава эфирного масла сбора №3
Компонентный состав эфирного масла из сбора №4 также представлен как монотерпеновыми, так и сесквитерпеновыми углеводородами (рис.9). В максимальном количестве содержатся п-аллил-анизол (30,68%), цис-5-метил-2-(1-метилэтил)-циклогексанон (7,33%), ментол (3,41%), азулен (4,71%), эудесма-5,11(13)-диен-8,12-олид (8,36%), производные нафтофурана (5,56%), α-1-нафталенпропанол (4,66%), пулегон (2,78%), камфора (2,74%), туйон (2,04%), эвкалиптол (1,73%), в меньшем количестве: кариофиллен, спатуленол, ледол, копаен, кадинол, α-бисаболен, α-лимонен.
Рис.9 Хроматограмма компонентного состава эфирного масла сбора №4
В сборах №1 и №3 проводили также количественное определение глицирризиновой кислоты, в связи с наличием ее в корнях солодки, входящей в их состав, методом ВЭЖХ. Для анализа получали спиртовое извлечение с экспериментально подобранными условиями экстракции. Глицирризиновая кислота идентифицировалась по времени удерживания стандартного образца. Расчет количественного содержания глицирризиновой кислоты производили методом абсолютной калибровки с помощью компьютерной программы МультиХром для «Windows» и по формуле. Анализируя полученные результаты можно отметить, что содержание глицирризиновой кислоты составило в сборе №1 - 1,75±0,03%, в сборе №3 - 1,24±0,02%.
Учитывая значение отдельных групп БАВ в оказании конечного лечебного эффекта для стандартизации сборов были выбраны:
- флавоноиды и дубильные вещества - в сборах №1 и №4, поскольку дубильные вещества при взаимодействии с раздраженной и воспаленной слизистой поверхностью желудка, кишечника образуют защитную пленку, предохраняющую от воздействия раздражающих агентов и микроорганизмов, а флавоноиды оказывают разностороннее действие на желудочно-кишечный тракт - спазмолитическое действие на гладкие мышцы кишечника, желчных путей, желчного пузыря, кровеносных сосудов, противовоспалительное, антисекреторное, гастропротекторное, иммуномодулирующее и др., что имеет значение при лечении хронического панкреатита, гепатита в стадии обострения и дисбактериоза;
- флавоноиды и полисахариды - в сборах №2 и №3, так как флавоноиды оказывают противоязвенное, капилляроукрепляющее действие, а в сочетании с полисахаридами оказывают потенциирующее влияние на иммуностимулирующее действие. Кроме того, сами полисахариды оказывают иммуномодулирующее, гипогликемическое действие и также принимают участие в общем противоязвенном эффекте, что имеет значение при лечении язвенной болезни желудка и хронического панкреатита, гепатита в стадии ремиссии.
Для разработки методик количественного определения выбранных групп БАВ в сборах нами были подобраны оптимальные условия проведения анализа: выбор экстрагента, соотношение сырья и экстрагента, измельченность сырья, время, кратность экстракции, аналитическая длина волны.
В ходе эксперимента при разработке методики количественного определения флавоноидов в сборах был использован метод дифференциальной спектрофотометрии с подбором оптимальных условий проведения. При этом, чтобы исключить влияние сопутствующих веществ, к спиртовым растворам извлечений из сборов и растворов-стандартов флавоноидов добавляли комплексообразующую добавку - спиртовый раствор алюминия хлорида (III), с которым флавоноиды образуют комплексы, устойчивые в кислой среде и наблюдается батохромный сдвиг УФ-спектра.
Рис. 10. Спектры поглощения: 1 – рутина, 2 – кверцетина, 3 – сбора №1, 4 – сбора №2, 5 – сбора №3, 6 – сбора №4
При сравнении дифференциальных УФ-спектров сборов и стандартных образцов ГСО рутина и кверцетина, присутствующих в большем числе компонентов сборов, установили, что максимум поглощения комплекса флавоноидов наблюдается для сбора №1 и №3 при длине волны 405 нм, сбора №2 – 395 нм, сбора №4 – 400 нм, а для стандартных образцов ГСО рутина – 410 нм, кверцетина – 430 нм (рис.10).
Спектры поглощения сборов имеют более близкие максимумы к спектру рутина, поэтому этот флавоноид был выбран в качестве доминирующего в сумме, на который в дальнейшем вели пересчет. Изучение влияния различных факторов на выход флавоноидов из сборов позволило выбрать оптимальные условия, при которых необходимо проводить их количественное определение (табл.5).
Таблица 5
Оптимальные условия количественного определения флавоноидов
| Условия количественного определения | Сбор №1 | Сбор №2 | Сбор №3 | Сбор №4 |
| Экстрагент (этиловый спирт) | 70% | 60% | 60% | 70% |
| Измельченность сырья | 5 мм | 3 мм | 5 мм | 3 мм |
| Соотношение сырье – экстрагент | 1:100 | |||
| Время и кратность экстракции | Трехкратная экстракция по 30 мин | |||
| Длина волны | 408 нм | 403 нм | 408 нм | 405 нм |
| Концентрация комплексообразователя | 5% спиртовый раствор AlCl3 | |||
| Количество добавляемого комплексообразователя | 3 мл | 2 мл | 2 мл | 1 мл |
| Время комплексообразования | 30 мин и комплекс стабилен в течение 1 часа | |||
Метрологические характеристики методики количественного определения флавоноидов в сборах отражены в таблице 6.
Таблица 6
Метрологическая характеристика методики количественного определения флавоноидов в сборах
| Объект исследов. | f | x | S | Sx | P | t (P,f) | x | ε,% |
| Сбор №1 | 9 | 1,75 | 0,0221 | 0,00690 | 95 | 2,26 | 0,05 | 2,86 |
| Сбор №2 | 9 | 1,14 | 0,0195 | 0,00617 | 95 | 2,26 | 0,04 | 3,51 |
| Сбор №3 | 9 | 1,31 | 0,0164 | 0,00519 | 95 | 2,26 | 0,04 | 3,05 |
| Сбор №4 | 9 | 1,43 | 0,0197 | 0,01028 | 95 | 2,26 | 0,04 | 2,80 |
Отсутствие систематической ошибки методики подтверждено «опытами с добавками» ГСО рутина. Результаты определения представлены в таблице 7.
Таблица 7
Определение флавоноидов с добавками стандартного вещества
| Содержание флавоноидов мг | Добавлено рутина, мг | Должно быть фла-воноидов, мг | Найдено флавоноидов, мг | x, мг | , % |
| Сбор № 1 | |||||
| 17,235 | 0,25 | 17,485 | 17,835 | 0,35 | 1,96 |
| 17,338 | 0,50 | 17,838 | 18,048 | 0,21 | 1,16 |
| 17,514 | 0,75 | 18,264 | 17,944 | -0,32 | 1,78 |
| Сбор № 2 | |||||
| 11,435 | 0,25 | 11,685 | 12,015 | 0,33 | 2,75 |
| 11,387 | 0,50 | 11,887 | 12,287 | 0,40 | 3,25 |
| 11,506 | 0,75 | 12,256 | 11,956 | -0,30 | 2,51 |
| Сбор № 3 | |||||
| 13,243 | 0,25 | 13,493 | 13,273 | -0,22 | 1,66 |
| 13,347 | 0,50 | 13,847 | 14,117 | 0,27 | 1,91 |
| 13,186 | 0,75 | 13,936 | 14,286 | 0,35 | 2,45 |
| Сбор № 4 | |||||
| 14,346 | 0,25 | 14,596 | 14,176 | -0,42 | 2,96 |
| 14,538 | 0,50 | 15,038 | 15,428 | 0,39 | 2,53 |
| 14,305 | 0,75 | 15,055 | 15,495 | 0,44 | 2,84 |