Использование методов биотехнологии для получения здорового посадочного материала осины ( populus tremula L.) В условиях республики татарстан 06. 03. 01 Лесные культуры, селекция, семеноводство

Вид материала

Лекция

Содержание Общая характеристика работы Цель и задачи исследований. Научная новизна работы. Практическая ценность. Положения, выносимые на защиту Личный вклад автора Обоснованность выводов и степень достоверности результатов Апробация работы. Структура и объем диссертации Основное содержание работы 2. Природные условия района исследования 3. Объекты и методика исследований 4. Изучение сомаклональной изменчивости 4.2. Получение растений-регенерантов осины из каллусной ткани 4.3. Морфофизиологические характеристики растений-регенерантов 5. Размножение осины методом « 5.2. Собственно микроразмножение 5.3. Укоренение микропобегов осины 5.4. Адаптация пробирочных растений к почвенным условиям Рекомендации производству ... Полное содержание

Подобный материал:

• Выращивание селекционного посадочного материала яблони в ботаническом саду им. Вс., 681.03kb.
• Отбор дуба для использования его древесины в виноделии 06. 03. 01 Лесные культуры,, 510.4kb.
• Рекреационная ценность лесопарковых ландшафтов и возможности ее повышения (на примере, 363.65kb.
• Создание исходного материала для селекции барбариса ( berberis L.) В условиях юго-запада, 480.16kb.
• Конкурс проводится Центральной избирательной комиссией Республики Татарстан совместно с Министерством культуры Республики Татарстан и, 78.63kb.
• Селекция баклажана для аридной зоны нижнего поволжья 06. 01. 05 Селекция и семеноводство, 336.5kb.
• Создание сортов и совершенствование технологии возделывания луковых культур в условиях, 767.7kb.
• Чайковского Управления Культуры города Казани; диплом, 36.78kb.
• Кабинет Министров Республики Татарстан проект закон, 1470.26kb.
• Республики Татарстан «Осоциальной политике в Республике Татарстан», 248.31kb.

На правах рукописи


Петрова Гузель Анисовна


ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ

ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА ОСИНЫ (POPULUS TREMULA L.) В УСЛОВИЯХ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН


06.03.01 – Лесные культуры, селекция, семеноводство


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата сельскохозяйственных наук


Москва – 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный аграрный университет»


Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор А.Х. Газизуллин


Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор А.Р. Родин


кандидат биологических наук,

доцент О.Ю. Миронова


Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт

лесоводства и механизации лесного хозяйства


Защита диссертации состоится «27» апреля 2011 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.146.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет леса» по адресу: 141005, Московская область, г. Мытищи-5, ул. 1-Институтская, 1.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета леса


Автореферат разослан «___» марта 2011 г.


Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат сельскохозяйственных наук Васильев С.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность темы. Для удовлетворения все возрастающей потребности общества в древесине и продуктах ее переработки следует повысить продуктивность существующих и создать новые высокопродуктивные лесные насаждения. Повышение продуктивности лесов возможно в первую очередь за счет выращивания быстрорастущих древесных пород, особенно высококачественных форм местных пород.

Одной из таких пород является осина. Это – быстрорастущая древесная порода, возраст спелости ее древостоев наступает в 2-2,5 раза быстрее нежели хвойных пород и дуба. Древесина здоровой осины пользуется большим спросом как строительный и поделочный материал, а также в спичечной, целлюлозно-бумажной промышленности, производстве мебели и т.д. Однако, несмотря на это, в нашей стране древесина осины в целлюлозно-бумажной промышленности используется мало, в то время как за границей она имеет широкое применение в производстве специальных сортов бумаги. Плита OSB из длинноразмерной стружки изготавливается из балансовой и несортовой древесины осины и других пород в Канаде, США и других странах, и находит все большее применение в мебельной промышленности и в домостроении, вытесняя фанеру и ДСП. В Финляндии расширяется спрос на древесину осины в связи с развитием технологий целлюлозно-бумажной промышленности, особенно для производства специализированных видов бумаги. (Газизуллин и др., 2007).

К сожалению, осина сильно поражается грибными болезнями вызывающими сердцевинную гниль стволов, вследствие чего древесина осиновых древостоев характеризуется весьма низкой товарностью. Оздоровление осинников республики – одна из наиболее трудных и наиболее важных проблем лесного хозяйства страны. Размножать осину семенами трудно, так как они очень быстро теряют всхожесть, кроме того, полученное потомство будет наследовать ценные качества лишь частично. Вегетативное размножение осины черенками затруднено из-за плохой укореняемости. Также, при черенковании имеется опасность распространения скрытых инфекций, которые проявляются уже в лесных культурах.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения – клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro неполовым путем растений генетически идентичных исходному экземпляру). Технология размножения ценных клонов осины методом in vitro позволяет преодолеть трудности, возникающие при традиционных способах размножения. Микроклональное размножение позволяет переводить на промышленную основу и получать достаточное количество посадочного материала. Этот метод до сих пор не использовался в Татарстане с целью получения посадочного материала из элитных клонов осины.

Цель и задачи исследований. Целью нашего исследования является усовершенствование методов биотехнологии для получения здорового посадочного материала осины в условиях Республики Татарстан. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить современное состояние осинников Республики Татарстан;

- освоить технологию размножения ценных клонов осины методом «in vitro»;

- изучить особенности морфогенеза осины в условиях in vitro;

- провести наблюдения и изучить сомаклональную изменчивость растений в процессе размножения осины in vitro в лабораторных условиях;

- изучить особенности адаптации к условиям in vivo диплоидных и триплоидных растений-регенерантов осины.

Научная новизна работы. Впервые для республики Татарстан были проведены исследования по оздоровлению и выращиванию безвирусного быстрорастущего посадочного материала осины с применением метода клонального микроразмножения. Усовершенствована технология регенерации растений из первичной и пересадочной каллусной ткани. Выявлены особенности сомаклональной изменчивости растений, полученных из первичной и пересадочной каллусной ткани, по физиолого-биохимическим показателям. Установлено, что у растений, обладающих быстрым ростом на протяжении 5 пассажей, суммарное содержание растворимых фенольных соединений было на уровне 30 – 33 мг/г сырой массы, а у растений с медленным ростом данный учитываемый показатель существенно возрос и составил 52-58 мг/г сырой массы. Обнаружены изменения и на уровне числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц у быстрорастущих и медленнорастущих растений. Наибольшее их количество было обнаружено у быстрорастущих растений, и наоборот – наименьшее – у медленнорастущих.

Практическая ценность. Освоение этого метода в условиях Республики Татарстан и внедрение результатов исследования в промышленную технологию размножения элитных клонов осины позволяет заменить малоценные насаждения осины на здоровые, высокопродуктивные и устойчивые к гнили. Это существенно повысит товарность и продуктивность осиновых древостоев республики. Изучение роста полученных in vitro диплоидных и триплоидных растений проходит в дендросаде Сабинского лесничества. Полученные результаты применяются в учебном процессе при чтении курса по дисциплине «Генетика».

Положения, выносимые на защиту:

- Особенности сомаклональной изменчивости в процессе размножения осины «in vitro»;

- Особенности морфогенеза осины в условиях in vitro;

- Влияние генотипа осины на рост и развитие растений-регенерантов (диплоидные и триплоидные формы).

Личный вклад автора заключается в постановке цели, задач, разработке программы, выборе объектов и методике их изучения, проведении экспериментов, обработке и анализе материала, формулировке положений и выводов.

Обоснованность выводов и степень достоверности результатов проведенных исследований подтверждается большим объемом проведенных исследований, современной математической обработкой данных с использованием компьютерной техники, методов математического анализа и стандартных пакетов программ.

Апробация работы. Научные разработки были представлены на всероссийских конференциях (Казань 2005, 2006, 2007), на VIII молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2008), на Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 145-летию Академии имени К.А Тимирязева (Москва, 2010), опубликована статья в рецензируемом ВАК журнале «Вестник Казанского ГАУ» (Казань, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из которых одна статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста. Содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, экспериментальную часть, выводы, заключение, а также приложение и список цитируемой литературы, который включает 183 источника, из которых 14 на иностранном языке. Диссертация содержит 19 рисунков, 14 таблиц, 4 приложения.


ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА

Осина (Populus tremula L.) – представитель рода Populus (тополь), широко распространенная в России древесная порода, произрастающая на самых разнообразных почвах. Встречается как в лесной зоне, так и в лесостепи. Особенно велико значение осины как быстрорастущей древесной породы, легко возобновляющейся естественным путем. Осина является непременным спутником хозяйственной деятельности человека. Лесоводы признают, что распространению осины больше способствует деятельность человека, сплошные рубки, чем лесорастительные условия (Н.Е. Декатов 1931; В.З. Гулисашвилли, 1931; В.Г. Стороженко и др., 1987).

Осиновые леса произрастают в различных типах лесорастительных условий. В лесной зоне осина формирует как чистые древостои, а также встречается в виде примеси к сосновым и еловым древостоям, в лесостепной – в твердолиственных лесах (Михайлов, 1985). Изучением типов осиновых насаждений занимались многие ученые-лесоводы (И.Д. Юркевич, 1948, 1960; Е.Г. Орленко, 1957; Г.Л. Ремезова, 1959; В.С. Ипатов, 1960; В.П. Цепляев, 1961, А.С. Яблоков, 1963; И.Д. Юркевич и др., 1965; Я.Я. Смилга, 1986 и др.).

По данным Лосицкого К.Б. и Чуенкова В.С. (1980) в размещении насаждений с преобладанием мягколиственных пород, в том числе и осины, наблюдается определенная закономерность: их больше там, где преобладают хвойные насаждения, однако в Татарстане осинники в основном в зоне лесостепи, там естественных насаждений хвойных пород нет. Это свидетельствует о происходящей смене пород. Исследованиями в области смены пород занимались: Б.А. Ивашкевич (1915), В.Р. Вильямс (1950), И.С. Мелехов (1954), В.Д. Арещенко (1958), Г.П. Мотовилов (1959), П.С. Погребняк (1968), В.М. Глазырин (1970), В.П. Демиденко (1976), Г.С. Войнов (1976) и др. Осиновые леса в большинстве являются производными от еловых, дубовых, сосновых и др. При сплошной вырубке таких лесов обычно легко происходит смена пород, появляется в большом количестве осина и береза. Ветровалы ели в чистых или смешанных древостоях также вызывают смену её березой или осиной (Ткаченко, 1952). Но не во всех типах леса может происходить смена пород. Л.Е. Михайлов (1985) считает, что сосняки лишайниковые не сменяются осиной. Нет постоянной смены пород на осину в сосняках и ельниках сфагновых.

Виднейшие ученые русской лесоводственной науки неоднократно отмечали перспективность работ по селекции осины (Нестеров, 1887; Курдиани, 1912; Ткаченко, 1928 и др.). В России опыты по селекции осины были начаты в 1935 г. Одним из способов ускорения роста, улучшения качества древесины и формы ствола, усиления устойчивости против неблагоприятных климатических условий и болезней является гибридизация. В нашей стране гибридизацией в роде Populus занимались П.Л. Богданов (1932), А.В. Альбенский (1934), Березин (1934), А.С. Яблоков (1935, 1963), М.Д. Колесников и Ф.Л. Щепотьев (1936), С.Н. Багаев (1967) и др. Гибридизацией осины занимаются и за рубежом, особое внимание уделяя гибридам осины с американской осиной, так как они отличаются быстротой роста.

В 1937 г. А.С. Яблоковым в Шарьинском лесхозе Костромской области была обнаружена исполинская форма осины (Яблоков, 1941, 1949, 1963). Позже такая форма осины была найдена С.П. Иванниковым в Обоянском лесхозе Курской области (Иванников, 1952, 1958, 1965, 1966). Впервые исполинскую форму осины нашел и описал в Швеции в 1935 г. проф. Нильсон-Эле, на полуострове Лилло. Исследования упомянутых выше и других авторов показали, что триплоидные осины (с тройным набором хромосом) значительно превосходят диплоидные (имеют двойной набор хромосом) по росту в высоту и толщину, по некоторым анатомо-морфометрическим показателям, обладают большой устойчивостью к грибным болезням.

Формовому разнообразию осины, ее продуктивности и устойчивости против гнили в разных типах леса посвящены работы М.Л. Дворецкого (1940), Е.Г. Орленко (1957, 1958), Ю.Ф. Косоурова (1958), С.С. Мясоедова (1958), В.М. Микалайкевичуса (1959), М.М. Оямаа (1961), Я.Я. Смилги (1963), В.И. Пчелина и М.Д. Данилова (1972), Алексеева И.А. (1977), В.И. Пчелина (1995), Е.Г. Баранчугова, (2005) и др. В природе наблюдается большое разнообразие форм осины. Различия выражаются в нервации и сроках распускания листьев, их осенней окраске, опушении побегов, цвете коры и т.д.

Способность осины к поражению грибными болезнями отмечена многими русскими лесоводами (Варгас де Бедемар 1848; П. Кнорре 1880; Н.С. Нестеров 1887; Б.А. Куницкий 1888; В.И. Гужавин, 1931; П.Н. Борисов, 1934, 1941; В.С. Ермилова, 1939; Н.Е. Декатов 1941; А.С. Яблоков 1963; В.С. Мирошников, Н.И. Федоров, 1969; И.Г. Кирсанов 1971; В.И. Пчелин, М.Д. Данилов, 1972; Л.В. Любарский, Л.Н. Васильева, 1975; С.Б. Кочановский 1976; В.А. Алексеев 1976; А.М. Жуков 1978; В.Г. Строженко, 1979; Е.Г. Баранчугов, 1982, 1983, 1987 и др.). Согласно данным этих исследователей можно сделать вывод об определенном влиянии почвенно-климатических условий произрастания на пораженность осинников грибными болезнями.

Использование достижений генетики и селекции в практике лесного хозяйства позволяет в полной мере использовать большие потенциальные возможности генетических ресурсов для сохранения и приумножения лесных богатств (Калинин и др., 1992). Для промышленного размножения лесных древесных растений методом клонального микроразмножения очень важно использовать в качестве исходного материала ценные формы, сорта, гибриды. Из литературных данных следует, что растения осины (растения рода Populus) являются объектом исследования по культуре тканей.

Первые работы в области развития метода культуры изолированных тканей растений относятся к концу XIX – началу XX вв. и связаны с именами таких выдающихся немецких ученых, как H. Vöchting (1892), K. Rechinger (1893) и H. Haberlandt (1902). Опыты по микроклональному размножению тополей проводили Сиволапов А.И. и Машкина О.С. (1999), Г.П. Бутова и Т.М. Табацкая (1975, 1988) и др. Исследованиями в области микроклонального размножения осины занимались Мэзес (1964); Винтон (1968, 1970); М.Р. Ахуйа (1983); К.Х. Барокка (1985); М.А. Тропа (1990); О.С. Машкина и др. (1999); Чмыр и др., 2001; Подольская и др., 2002, 2003; Шабунин, Подольская, 2005 и др.


2. ПРИРОДНЫЕ УСЛОВИЯ РАЙОНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Татарстан расположен в центре Российской Федерации на Восточно-Европейской равнине в месте слияния двух крупнейших рек – Волги и Камы. Общая площадь республики – 68 тыс. кв. км. Протяженность территории – 290 км с севера на юг и 460 км с запада на восток. Границ с иностранными государствами республика не имеет. Основными реками территория Республики Татарстан делится на пять физико-географических районов: Предволжье, Западное Закамье, Восточное Закамье, Восточное Предкамье, Западное Предкамье. Территория республики представляет собой равнину в лесной и лесостепной зоне с небольшими возвышенностями на правом побережье Волги и на юго-востоке республики. Рельеф Республики Татарстан в разных частях территории имеет неодинаковое расчленение. На территории республики встречаются и низкогорные формы и низменности, возвышенные плато и слабоволнистые равнины, и сильнорасчлененные эрозией территории, и участки, где эрозионные формы выражены весьма слабо. Республика богата водными ресурсами. Здесь протекают Волга, Кама, Вятка, Белая и большое количество малых рек. На территории Татарстана развиты следующие типы автоморфных почв: в таежной зоне – подзолистые, в зоне лиственных лесов – серые лесные и в лесостепной зоне – черноземные. Современные почвы Татарстана развиваются на продуктах гипергенеза (выветривания) – рыхлых отложениях четвертичного возраста, которые чрезвычайно благоприятны для почвообразования. Для почв РТ характерен промывной тип водного режима, когда имеет место ежегодное промачивание всей почвенно-грунтовой толщи до грунтовых вод. Климат республики умеренно-континентальный бореальный. Зимы снежные, умеренно-холодные. Лето жаркое, часто с засушливым периодом. Атмосферное количество осадков за год по республике составляет 400-520 мм. Климатические условия района исследования позволяют формировать здесь продуктивные осиновые фитоценозы. Более 17 % территории республики покрыто лесами, состоящими преимущественно из лиственных пород, хвойные породы представлены сосной и елью.


3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служила осина (Populus tremula L.), клоны №34 и №35, устойчивые к сердцевинной гнили, выращенные в тремулетуме Костромской ЛОС (Багаев, Багаев, 1990). Клон №34 диплоид – f2, а №35 – триплоид f 11, а также клоны, произрастающие в Матюшинском участковом лесничестве Пригородного лесничества Республики Татарстан (квартал 81). Для клонального микроразмножения в качестве первичного экспланта использовали молодые побеги.

Экспериментальную работу проводили в лабораторных условиях на базе кафедры сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева и в лаборатории лесовосстановления СПбНИИЛХ. В основе исследования была использована методика для размножения осины в условиях in vitro, разработанная Калашниковой Е.А. и Шабуниным Д.А.

Питательные среды. Для выращивания регенерантов осины из первичного экспланта и получения каллусной культуры осины использовали питательную среду с минеральными солями по прописи Мурасига и Скуга с добавлением витаминов, сахарозы и фитогормонов в различных концентрациях и соотношениях. При получении регенерантов осины из первичного экспланта в качестве ауксинов изучали действие НУК (0,02 мг/л) и ИМК (для укоренения микропобегов) (2 мг/л), а в качестве цитокининов – БАП (0,5; 0,1 мг/л). Для получения каллусной культуры осины в качестве ауксинов использовали 2,4-Д (2,5 мг/л) и НУК (0,5 мг/л), а в качестве цитокининов – цитодеф (2,0 мг/л) и БАП (0,5 мг/л). Для регенерации растений из каллусной ткани использовали питательную среду WPM, содержащую ауксин ИУК (0,5 мг/л) и цитокины – 2iр (2 мг/л) и БАП (2 мг/л).

Клональное микроразмножение осины. В опыте был использован основной метод клонального микроразмножения растений – активация развития уже существующих в растении меристем.

В качестве первичного экспланта были использованы вегетативные почки с молодых побегов устойчивых к сердцевинной гнили клонов осины №34 и №35. Почки вводили в культуру in vitro с декабря по март, так как меристема, сосредоточенная в почках в это время хорошо подвергается стерилизации.

Готовый растительный материал с помощью длинного пинцета помещали на питательную среду. Колбы ставили в световую комнату. Образовавшийся в колбах конгломерат побегов делили, удаляли скальпелем листочки и черенковали на сегменты стебля с одной или двумя пазушными почками. После чего его переносили на свежую питательную среду. После 3-х пассажей микропобеги укореняли in vitro. Регенеранты выращивали в световой комнате в течение 30 суток при 23⁰С, 24 часовом фотопериоде (круглосуточное освещение) и интенсивности освещения 1250 люкс.

В мае месяце выращенные растения-регенеранты осины были высажены в теплицу на территории дендрария Сабинского лесничества Республики Татарстан. Адаптацию пробирочных растений проводили в условиях теплицы, которая была оснащена установкой искусственного тумана. Растения-регенеранты извлекали из стерильных культуральных сосудов с помощью длинного пинцета. Корни отмывали от остатков агара и высаживали в почвенный субстрат. В качестве субстратов использовали: а) почвогрунт + песок (1:1); б) почвогрунт + дерновая почва + песок (1:1:1); в) почвогрунт. Почвогрунт, разработанный Параньгинским торфопредприятием РМЭ, состоял из доступных форм азота (NH₄+NO₃) – не менее 130мг/л, фосфора (Р₂О₅) – не менее 250 мг/л; калия (К₂О) – не менее 400 мг/л, массовая доля влаги – не более 65%, рН солевой суспензии – 6,6. Дерновая почва была взята в насаждении липы мелколистной.

Регенеранты высаживали в субстрат теплицы, а также в приготовленные заранее пикировочные пакеты. Перед высадкой регенерантов субстрат обильно промывали водой. Пакеты с растениями также помещали в теплицу с относительно регулируемым температурным режимом (20-22°С), освещенностью не более 5 тыс. лк. Относительная влажность воздуха изменялась от 90% до 65% по мере акклиматизации растений. Для лучшего роста растений были созданы условия искусственного тумана. С первых же дней после посадки, растения подкармливали растворами минеральных солей «Кемира люкс». Норма удобрений: 20 г удобрения на 10 л насыпного торфа + 35 г СаСО₃ (мел, известь).

Высадку пробирочных растений проводили во второй половине мая. На протяжении всего периода приживаемости растений (первые 10 дней) температура воздуха на улице составляла +30⁰С и выше.

Полученные результаты были обработаны методами статистики с применением программы «Statgrafics».

Получение каллусной культуры осины и дифференциация растениий-регенерантов. Для получения каллуса в качестве первичного экспланта были использованы черенки с вегетативными почками, нарезанные с однолетних побегов 5-6 летних корневых отпрысков устойчивых к сердцевинной гнили клонов осины, произрастающих в Матюшинском участковом лесничестве Пригородного лесничества Республики Татарстан (квартал 81).

Готовый растительный материал с помощью стерильного пинцета горизонтально помещали в чашки Петри и в пробирки с питательной средой MS, содержащей в качестве стимуляторов каллусогенеза ауксины 2,4-Д (2,5 мг/л) и НУК (0,5 мг/л) и цитокинины – цитодеф (2,0 мг/л) и БАП (0,5 мг/л). Чашки Петри и пробирки с эксплантами закрывали плёнкой Parafilm (США) и ставили в световую комнату, где поддерживали температуру 22-25⁰С.

Для дальнейшего формирования растений-регенерантов полученную каллусную ткань пересаживали на питательную среду с новым составом, содержащей в качестве ауксина ИУК (0,5 мг/л) и цитокины – 2iр (2 мг/л) и БАП (2 мг/л). Пересадку осуществляли 1 раз в 1,5 месяца. Условия выращивания были стандартные.

Определение содержания суммы растворимых фенольных соединений проводили по следующей методике: навеску сырого материала 800 мг растирали в 70% водном этаноле. Доводили объем жидкости до 10 мл, помещали на качалку на 1 час при 20°С, центрифугировали при 3000 об/мин 10 минут (центрифуга Т-23, Польша). Определение в надосадочной фракции проводили с помощью реактива Фолина-Дениса (Шевелуха и др., 2004): 0,5 мл этанольного экстракта смешивали с 6,5 мл Н₂О и 0,5 мл реактива Фолина-Дениса. Через 3 мин. добавляли 1 мл водного насыщенного раствора соды Na₂C0₃ и 2 мл Н₂0. Через 1 час экспонирования в комнатных условиях спектрофотометрировали раствор при 725 нм и рассчитывали по калибровочной кривой.

Опыт проводили в 3 аналитических и 5 биологических повторностях. Результаты экспериментов статистически обработаны с использованием программы Straz и Excel. Проведен дисперсионный анализ и определена наименьшая существенная разница (НСР₀₅), а также найдена стандартная ошибка или ошибка выборочной средней.

Цитологические исследования по подсчету числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц проводили в соответствии с практикумом по цитологии и цитогенетике растений (Пухальский и др., 2007). Подсчет числа хлоропластов проводили на листовых пластинках, которые изолировали с пробирочных растений осины двух типов формирования: активно растущие и медленно растущие побеги. Листья помещали в концентрированную уксусную кислоту на 24 часа, после чего их промывали и окрашивали 5% раствором хлористым бромом. Препараты просматривали под микроскопом и фотодокументировали.