Подготовка научных кадров по физико-химической биологии и биотехнологии
| Вид материала | Документы |
- Институт пищевой биотехнологии и геномики Национальной академии наук Украины, 2342.88kb.
- Рабочая программа по дисциплине Аналитическая химия и физико-химические методы анализа, 414.04kb.
- Курсовой или дипломной работы в отделе эволюционной биохимии нии физико-химической, 15.25kb.
- Образовательный стандарт специальность: 170500 [240801] «Машины и аппараты химических, 187.74kb.
- 2005 –№41 Рубрика: Проблемы подготовки, сохранения и развития кадров российской науки, 99kb.
- Энерго- и ресурсосберегающие процессы в химической технологии, нефтехимии и биотехнологии, 481.05kb.
- Решение этих проблем непосредственно связано с изучением цитоэмбриологических, физиологических, 271.54kb.
- Основанное на научных исследованиях воспроизводство научных и педагогических кадров,, 229.69kb.
- Рабочая программа дисциплины компьютерные моделирующие системы в химической технологии, 239.63kb.
- Вопросы к зачету по курсу "Основы биотехнологии", 27.24kb.
Динамические и гидрофобные характеристики α-токсинов яда скорпионов как основа селективности действия насекомые–млекопитающие (совместно с лабораторией нейрорецепторов и нейрорегуляторов).
Для ряда α-нейротоксинов из яда скорпионов, отличающихся селективностью действия «насекомые–млекопитающие», проведено моделирование динамических свойств и гидрофобных характеристик, позволившее найти важное отличие между группами токсинов, действующих на потенциал-чувствительные Na+-каналы (ПЧНК) млекопитающих и насекомых. Кроме того, отличия были обнаружены и в гидрофобных характеристиках петель ПЧНК, предположительно участвующих в связывании этих токсинов. Найденное соответствие позволяет построить модель взаимодействия α-токсинов с IV потенциал-чувствительным доменом ПЧНК.
Характеристические участки поверхности белков как функциональные детерминанты их активности.
Для выявления характеристических участков поверхности токсинов была разработана методика, основанная на расчете значений молекулярного гидрофобного потенциала, кривизны и электростатического потенциала в каждой точке поверхности. Это позволяет одновременно характеризовать как полярные, так и геометрические свойства поверхности. Разработанные методики были оптимизированы для анализа набора поверхностей белков, полученных в ходе расчета их молекулярной динамики. Анализ таких функциональных детерминант (характеристических участков поверхности) был выполнен для ряда α-токсинов из яда скорпионов и пауков. В результате были найдены аминокислотные остатки, формирующие эти участки поверхности, в основном ароматические и заряженные. Полученные данные были сопоставленны с имеющими данными мутагенеза для исследуемых молекул. Интересно, что выявленные остатки также являются остатками, ключевыми для активности токсина.
Биотехнология (51)
Исследование нанобиоструктур методами сканирующей зондовой микроскопии
Группа электронной микроскопии
При помощи СЗМ высокого разрешения, на примере рекомбинантных спидроинов 1F9 и 2E12 обнаружена новая форма надмолекулярной агрегации белков паутины – ламели. Методом атомно-силовой микроскопии показано, что, в них молекулы имеют конформацию плоского зигзага. Также в данной работе впервые получены изображения отдельных молекул рекомбинантного спидроина. Средняя толщина ламелий (высота над подложкой) составляет 0,6±0,2 нм для 1F9 и 0,7±0,2 нм для 2Е12. Эти значения были получены путем усреднения высот, измеренных на ста сечениях. Поскольку ламели из белков 1F9 и 2Е12 имеют близкие высоты, а сами белки имеют сходную структуру, то можно предполагать одинаковую конформацию молекул, находящихся в составе ламелей. Отметим, что на АСМ-изображениях ламели имеют практически постоянную ширину. Хотя ширина объектов не может быть измерена с высокой точностью из-за конечного радиуса кривизны зонда (ширина ламели, измеряемая на половине высота, составляла 11-18 нм для обоих белков, значение существенно зависело от конкретного используемого зонда), постоянство ширины однозначно следует из имеющихся изображений, и оно важно для выяснения способа укладки молекул. Хотя длины ламелей варьируются в широких пределах, видно, что ламели белка 1F9 имеют большую протяженность, чем ламели 2E12. Предположительно, это связано с присутствием остатков пролина в белке 2Е12, которые мешают образованию протяженной регулярной укладки.
Было проведено сопоставление морфологии нитей после растворения белка двумя способами. Изображения нитей на слюде, полученные после обработки 1F9 в гуанидин тиоцианате и в смеси LiCl с муравьиной кислотой, сопоставлены на рисунке 1. Видно, что наблюдаемые структуры морфологически сходны, и это говорит о том, что их формирование не является результатом обработки белка конкретным хаотропным агентом.
Длина протяженных структур, адсорбированных вторым слоем, для обоих белков варьируется в широких пределах от 20 до 250 нм. При дальнейшем повышении концентрации раствора подложка быстро целиком покрывается белком. При помощи СЗМ высокого разрешекния показано, что молекулы рекомбинантных спидроинов могут существовать в водных растворах в двух разных агрегационных состояниях: в виде нанофибрилл и в виде отдельных молекул. Впервые обнаружено, что молекулы рекомбинантных белков паутины могут агрегировать с образованием ламелей, в которых каждая молекула имеет конформацию зигзага. Показано, что возможность формирования ламелей не зависит от использования конкретного хаотропного агента. Укладка молекул в составе ламелей в конформации плоского зигзага подтверждается наблюдаемыми размерами ламелей, а также существующими представлениями об укладке хиральных молекул, имеющих тенденцию к образованию антипараллельных бета-листов.
Совершенствование биотехнологических процессов получения субстанций генно-инженерного инсулина человека и его аналогов
Группа прикладных исследований пептидов и белков
Создана методологическая база для получения три-N-замещенных производных генно-инженерного инсулина человека и его аналогов с тремя одинаковыми, двумя или тремя различными заместителями. Разработаны способы селективного ацилирования α-аминогрупп остатков GlyA1 и PheB1 и ε-аминогруппы остатка LysB29 инсулина человека. Исследованы условия получения три-N-замещенных производных генно-инженерного инсулина человека и инсулина лизпро с различным сочетанием лигандов: с двумя и тремя различными заместителями. Синтезированы новые три-N-замещенные соединения: ди-NαA1,NαB1-липоил-NεB29(B28)-стеароил инсулин (инсулин лизпро), а также NαA1-липоил-NαB1-биотинил-NεB29-стеароил инсулин. Обнаружена высокая устойчивость модифицированных производных к протеолизу в сравнении с исходными гормонами. Показано, что синтезированные соединения обладают высокой гипогликемической активностью и увеличенной длительностью гипогликемического действия.
Оптимизированы способы получения и выделения и очистки рекомбинантной IgA1 протеазы N.meningitidis и ее мутантной формы, используя ранее полученные штаммы. Основное внимание было уделено процессам очистки телец включения, их растворению и ренатурации денатурированного белка. При этом варьировались состав и рН буферных растворов, концентрации и природа детергентов и восстанавливающих агентов, концентрации белков, времени и температуры проведения процессов, методы рефолдинга. Наибольший выход активной и мутантной IgA1 протеазы в процессе рефолдинга получен при использовании белков, предварительно очищенных хроматографическими методами в денатурирующих условиях. Максимальный выход целевых белков при хроматографической очистке получен при использовании Q-сефарозы и Ni-агарозы. Оптимизированные способы получения IgA1 протеазы позволяют выделять высокоочищенные белки с выходом конечного продукта около 4 мг из 1 г биомассы.
Разработка молекулярно-генетических методов детекции патогенов и продуцируемых ими токсинов
Группа Молекулярная диагностика
Разработка тест-систем в формате «реального времени» для детекции грибов рода Fusarium по спектру продуцируемых ими токсинов.
Ввиду высокой межвидовой гомологии последовательностей нуклеотидов ДНК близкородственных видов, а также с целью уменьшения количества анализов, нами предложен подход, позволяющий с помощью одной пары праймеров детектировать несколько видов со сходным профилем продуцируемых микотоксинов. Анализ имеющихся в базе данных последовательностей нуклеотидов ДНК представителей рода Fusarium показал, что гены рРНК и β-тубулина высокогомологичны и не позволяют осуществить межвидовое разграничение. В качестве генетического маркера для подбора праймеров был выбран ген tef1α. Он обладает достаточной дивергенцией, кроме того известно, что степень гомологии последовательностей этого гена между разными видами коррелирует со спектром продуцируемых ими токсинов. Поэтому праймеры подбирали к участкам гена, консервативным в пределах выбранной группы, но вариабельным между группами.
На основании известных данных о спектре продуцируемых вторичных метаболитов было разработано 4 пары специфических праймеров и 3 флуоресцентно-меченых зонда, обеспечивающих детекцию результатов ПЦР в формате «реального времени». Специфичность олигонуклеотидов показана в тестах на 38 моноспоровых изолятах грибов рода Fusarium 12 видов. Кроме того, определена чувствительность тест-систем, которая составила 102 копий специфической ДНК на реакцию. Разработанная система является перспективной с точки зрения создания на её основе стандартных наборов для рутинной диагностики возбудителей фузариоза. Данные, получаемые с помощью таких наборов, позволяют охарактеризовать видовой состав патогенов в партии зерна и продуктах его переработки и спрогнозировать, какие микотоксины могут накапливаться в процессе хранения и транспортировки.
Оптимизация методики проведения иммуно-ПЦР для детекии токсина А и токсина тканевого шока золотистого стафилококка
Для проведения иммуно-ПЦР использовали надмолекулярные комплексы, формируемые из фрагментов ДНК, биотинилированных с двух концов, и стрептавидина. Для приготовления комплексов использовали биотинилированную по обеим концам двухцепочечную ДНК длиной 750 пар оснований. Показано, что комплексы образуются быстро (менее 1-2 сек) и являются стабильными, при этом, по большей части, используется 2 «валентности» молекулы стрептавидина. Размер образуемых трехмерных комплексов зависит от молярного отношения стрептавидина и ДНК, используемых при их образовании. При соотношении 1:1 образуются наиболее протяженные комплексы электрофоретической подвижностью соответствующие ДНК размером 1500-50000 п.н. На первом этапе был разработан базовый протокол проведения иммуно-ПЦР. Для анализа использовали разведения чистого антигена от 100 нг/мл до 100 фг/мл. Таким образом оптимизирована методика проведения иммуно-ПЦР на токсины А и тканевого шока золотистого стафилококка с использованием надмолекулярных конъюгатов ДНК-стрептавидин и биотинилированных антител, с чувствительностью 1 пг/мл.
Получение и исследование новых полимерных материалов для биосепарации и биоанализа, иммобилизации клеток и молекул (ферментов, пептидов, биолигандов, ДНК и др.) и разработка новых методов и систем на основе предложенных материалов
Лаборатория полимеров для биологии
В ходе исследований (проведенных совместно с группой Молекулярной диагностики ИБХ РАН и МИТХТ им. М.В. Ломоносова) оптимизирован «матричный» метод получения композиционных полианилин-содержащих сорбентов. При этом в качестве полимерного модификатора использовали либо предварительно полученный (готовый) поликомплекс ПАНИ-полисульфокcилота, либо (как вариант) этот поликомплекс формировали непосредственно в процессе синтеза на поверхности носителя. Показано, что мономер (анилин) в процессе матричной полимеризации (где «матрицей» служит макромолекула поликислоты) расходуется на образование поликомплекса, т.е. собственно полимерного модификатора, а не на образование частиц ПАНИ в объеме реакционной смеси (которые в случае традиционной осадительной полимеризации загрязняют конечный продукт и требуют проводить интенсивную отмывку сорбента перед использованием). Получение указанного поликомплекса не требует применения низкомолекулярной кислоты в качестве допанта. Эффективность применения полученного композита продемонстрирована на ряде примеров выделения нуклеиновых кислот из различных источников.
Для получения стабильных при длительном хранении препаратов очищенных нуклеиновых кислот разработан новый способ получения композитов, модифицированных поликомплексами ПАНИ с полистиролсульфокислотой (отличающейся по строению и физико-химическим свойствам от применяемых ранее сополимерных поликислот).
Оптимизирован разработанный ранее метод озон-инициированной сополимеразции фтормономеров на поверхности обработанного озоном кремнезема, что позволило модифицировать, в среднем, по 20 г носителя за цикл. Эффективность использования озонированного кремнезема в качестве гетерогенного инициатора полимеризации была продемонстрирована при проведении окислительной полимеризации анилина в отсутствии традиционных для таких систем окислителей, растворимых в реакционной среде. Показано, что при инкубировании озонированного кремнезема в подкисленном водном растворе анилина, не содержащем низкомолекулярного окислителя, ПАНИ образуется только на только поверхности носителя. Равномерность образующегося ПАНИ покрытия подтверждали данными ртутной порометрии и тестами на гидролитическую стабильность. Измеренные толщины полимерного покрытия составили, в среднем, 8.5 нм. Значительное увеличение стабильности материала в условиях щелочного гидролиза (в 7 раз по сравнению с немодифицированным носителем) подтверждает, что бездефектное полимерное покрытие образуется как на внешней поверхности частиц носителя, так и на внутренней поверхности пор.
Продолжены работы по внедрению метода спектрально-фазовой интерференции (SPI 2, ИОФ РАН) в практику исследований процессов, протекающих на границе раздела фаз твердая поверхность/жидкость.
Были исследованы конформационные перестройки глобул иммобилизованной рекомбинантной олигопептидазы В при взаимодействии с субстратами с гидрофобными остатками в P2-положении Z-FR-pNA и Bz-PFR-pNA, и обнаружен необычный эффект ингибирования субстратом в области их высоких концентраций, значительно более выраженный в отсутствие ионов кальция.
Продолжены работы по изучению влияния состава подвижной фазы на образование комплексов между поверхностно-привитыми боронатсодержащими полимерами и муцином, и их разрушение в присутствии различных сахаров, прежде всего фруктозы.
Изучена динамика образования комплексов между иммобилизованным альгинатом натрия (Alg) и поливиниловым спиртом (ПВС), а также формирования многослойных наноразмерных пленок Alg/ПВС/поли-L-лизин (PLL). Разработана методика получения тонких (30-100 мкм) слабонабухающих Alg/ПВС, Alg/ПВС/PLL пленок. В условиях in vitro с использованием клеток HBL и клеток, полученных из лимбальной зоны глаза кролика, показано, что полученные пленки не оказывают выраженного цитотоксического воздействия на указанные клетки, в частности клетки лимба эффективно прикреплялись и распластывались по поверхности пленок, и сохраняли жизнеспособность, по крайней мере, в течение 14-20 суток. В условиях in vivo Alg/ПВС пленки разрушались (глаз кролика) в течение 2-3 суток, а Alg/ПВС/PLL пленки сохраняли свою целостность в течение, по крайней мере 8-10 суток, при этом в отсутствие любого медикаментозного лечения отмечается слабовыраженное воспаление глаза.
Выполнено физико-химическое исследование коммерческого препарата хитозана фирмы Sigma. Молекулярную массу полимера оценивали тремя независимыми методами:
капиллярная вискозиметрия, гель-проникающая хроматография и динамическое
светорассеяние. Проведена химическая модификация хитозана с целью оптимизации
амфифильных свойств и обеспечения растворимости при физиологическом значении pH.
Синтезированы конъюгаты с рядом пептидов-эпитопов и противоопухолевым
антибиотиком доксорубицином. Полученные препараты исследованы в экспериментах in
vitro и in vivo.
Оптимизированы условия экстракции IgA1-протеазы из цетавлонового осадка, относящегося к отходам производства менингококковой вакцины. Наиболее высокий выход получен при экстракции 0,05 М ацетатом аммония, рН 8 с добавлением пропилового спирта (20 %). После очистки методом адсобционной хроматографии на МПС-500 и методом гидрофобной хроматографии на фенилсефарозе получено приблизительно 1 мг IgA1-протеазы, удельная активность которой составляет 750 усл. ед./мг.
Разработан оптимизированный метод выделения из нормальной крови IgA1, пригодного для использования в качестве субстрата IgA1 протеиназы. Из 29 мл плазмы получено 35 мг очищенного IgA1 (чистота ок. 90%), который связывается с неактивной рекомбинантной IgA1 протеазой и расщепляется активной рекомбинантной IgA1 протеазой. По данным ИФА титр препарата IgA1 при концентрации белка 1 мг/мл составляет около 2,5 тыс. Полученный IgA1 можно использовать для характеристики и определения активности различных препаратов рекомбинантной и природной IgA1 протеиназы.
Разработаны биоматериалы для тканевой инженерии в виде биодеградируемых микроносителей на основе полилактидов (PLLA, PDLLA) и полилактида-ко-гликолида (PLGA) и полимерных гидрогелевых матриксов на основе модифицированного поливинилового спирта с модифицированной поверхностью, обеспечивающей хорошую адгезию клеток. В модели in vitro на основе мультиклеточных опухолевых сфероидов, полученных в микрокапсулах при культивировании аденокарциномы молочной железы человека (MCF-7), исследовано фотодинамическое воздействие двух фотосенсибилизаторов (Хе6 и ФС®); показано, что клетки в сфероидах более устойчивы к воздействию ФДТ, чем клетки в монослойной культуре (2D модель).
Разработка биотехнологии синтеза новых модифицированных нуклеозидов с помощью ферментов нуклеинового обмена
Лаборатория биотехнологии
Создание химико-ферментативных подходов к синтезу серии 2,6-пуринзамещенных
нуклеозидов серии рибозы и 2’-дезоксирибозы.
Получены предварительные данные о возможности синтеза нуклеозидов трех типов (рибо-, дезоксирибо- и арабино-) из 2-NAc-6-хлор-, 2-NAc-6-окси- и 2-NAc-6-метоксипуринов – ключевых синтонов для получения аналогов неларабина. Показано, что в реакции синтеза рибо- и дезоксирибозных производных 2-NAc-6-окси- и 2-NAc-6-метоксипурина в реакционных смесях присутствует два продукта с эквивалентными массами, что свидетельствует об образовании N7-,N9-изомеров нуклеозидов по пуриновому кольцу. В случае использвания в качестве донора арабинозы 1-β-D-арабинофуранозилурацила в реакции получается один продукт, структура которого устанавливается в настоящий момент. Целевые продукты из реакционной смеси выделялись с помощью обращеннофазовой хроматографии. Синтезированные соединения охарактеризованы данными ВЭЖХ, масс-спектрометрии и 1Н-ЯМР-спектроскопии.
Синтез новых аналогов противоопухолевого препарата Кладрибина, содержащие 3’-
амино-2’,3’-дидезоксирибозу. Проведение оценки их терапевтического потенциала,
наряду с Кладрибином, в культурах мононуклеарных клеток крови больных
различными формами рассеянного склероза (РС).
Фармацевтическая субстанция Кладрибина и два его принципиально новых структурных аналога (2-амино-6-хлор-пурин-2’-дезоксирибозид, iso-CdA; 3’-амино-2’,3’-дидезокси-2-хлораденозин, amino-CdA) получены в ИБХ РАН биотехнологическим способом с использованием генно-инженерных ферментов. В качестве исходных соединений в синтезе нуклеозидов использовались 2-амино-6-хлор-пурин, 2-фтораденозин и 2-хлораденозин, полученные по новой технологии в лаборатории биотехнологии ИБХ РАН. Остатки 3’-амино-2’,3’-дидезоксирибозы присоединяли к гетероциклическим основаниям с помощью генно-инженерных ферментов пуриннуклеозидосфорилаз по реакции трансгликозилирования. Этим способом были получены два соединения: amino-FdA, amino-CdA и 3’-N-оксим-CdA с выходами (72, 63 и 24 % соответственно). После изучения физико-химических характеристик синтезированных соединений созданы сертификаты соответствия со спецификациями, содержащими данные 1Н ЯМР спектроскопии, масс-спектрометрии и ВЭЖХ. На следующем этапе работ было проведено масштабирование технологии синтеза модифицированных нуклеозидов по разработанным нами способам, наработаны партии препаратов, достаточные для проведения первичного биологического скрининга в системах in vitro. Показано цитотоксическое действие аналогов Кладрибина на покоящиеся лимфоциты больных РС и здоровых доноров: средние концентрации, вызывающие 50%-ную гибель покоящихся МКПК (LD50) для Кладрибина лежат в диапазоне 0,003-0,01, для Аmino-FdA - в диапазоне 3-10 мкг/мл, a для Аmino-CdA - 10-30 мкг/мл. Таким образом, экспериментальные данные о цитостатической активности синтезированных соединений для клеток здоровых доноров и больных РС выявило существенно меньшую цитотоксичность amino-FdA и amino-CdA (по сравнению с Кладрибином). Изучение динамики влияния различных доз аналогов Кладрибина на пролиферативные свойства лимфоцитов выявило сходную картину ингибирования неспецифической пролиферацию МКПК как здоровых доноров, так и больных РС.Сравнение новых аналогов Кладрибина с исследованными ранее по мере убывания средних концентраций, вызывающих 50%-ную гибель покоящихся МКПК здоровых доноров и больных РС, позволило выстроить их в следующий ряд: CdA ≈ 2-F-dA < F-Ara-A < FMP ≤ Cl-Ara-A < OH-Ara-A ≈ 2-ОМе-dA < Amino-FdA < F,F-BI-dR ≈N-оксим-CdA ≤ Iso-CdA ≤ Amino-CdA. Сравнение новых аналогов Кладрибина с исследованными ранее по мере убывания средних концентраций, вызывающих 50%-ное ингибирование пролиферации МКПК здоровых индивидов и больных РС позволило выстроить их в следующий ряд: МК - CdA ≈ 2-F-dA < F-Ara-A < FMP ≤ Cl-Ara-A < Amino-FdA ≤ OH-Ara-A ≈ 2-ОМе-dA < F,F-BI-dR ≈N-оксим-CdA ≤ Iso-CdA< Amino-CdA.
Синтез клинически важных противоопухолевых нуклеозидов (кладрибина и клофарабина) с помощью каскадных ферментативных реакций.
Нами было доказано, что применение каскадного подхода к получению модифицированных нуклеозидов возможно не только для разработки способа синтеза уже известных соединений, но и для получения принципиально новых производных для последующего тестирования их биологической активности.
В 2011 г. проведены следующие работы:
- синтезирован ряд пентофураноз, модифицированных по С2 и/или С3 атомам углерода, и изучена их субстратная активность в реакциях, катализируемых РК;
- изучены сахара-пентофуранозы, проявившие удовлетворительную субстратную активность в РК реакции, в качестве исходных в каскаде ферментативных реакций ведущих к пиримидиновым (РК, ФПМ, УФ/ТФ) или пуриновым (РК, ФПМ, ПНФ) нуклеозидам;
- определен надежный химический метод синтеза D-пентофуранозо-1-фосфатов и их C2 и/или C3 модифицированных аналогов для использования в каскадном методе синтеза новых модифицированных нуклеозидов;
- синтезирован ряд перацилпроизводных пентофураноз, модифицированных при C2 и/или C3 атомах углерода и изучение их превращения в соответствующие пентофуранозо-1-фосфаы; изучена субстратная специфичность пентофуранозо-1-фосфатов в реакциях, катализируемых УФ, ТФ и ПНФ.
- Впервые проведен синтез клинически важных противоопухолевых нуклеозидов (кладрибина и клофарабина) с помощью каскадных ферментативных реакций.