Изучить омолаживающий эффект модификации гормонального фона и частичной иммуносупрессии, которые развиваются при беременности, на модели гетерохронного парабиоза

Вид материала

Документы

Содержание Целью данного исследования Задачи проекта Дизайн 1-го этапа эксперимента Дизайн 2-го этапа эксперимента Бюджет исследования.

Подобный материал:

• Предопухолевые заболевания женских половых органов вульва этиология, 213.84kb.
• Лабораторная работа 2 «Покрытие шрифтом фона», 11.73kb.
• Прогестерон при беременности, 150.23kb.
• Удк 681. 3 Формализованные понятийные модели для проектирования организационно-технических, 68.32kb.
• Курс (высшее) Тема Макроэкономическое равновесие в классической модели Ключевые понятия, 138.22kb.
• Обоснование выбора лечебного воздействия при дисменореи с учетом гормонального статуса, 271.06kb.
• GpsmapEdit редактор векторных карт, 143.94kb.
• Заболевания печени и желчевыводящих путей при беременности, 128.83kb.
• Разработка базы данных для восстановления расхода теплоносителя при частичной утрате, 31.65kb.
• Мы не сможем, используя данный ряд, построить такие модели как процесс авторегрессии,, 125.56kb.

Изучить омолаживающий эффект модификации гормонального фона и частичной иммуносупрессии, которые развиваются при беременности, на модели гетерохронного парабиоза

ГУ «Институт геронтологии АМН Украины», Киев

Лаборатория «Наномир», Москва


Старение организма – многофакторный процесс, обусловленный, в том числе, и утратой регенеративного потенциала стволовых клеток. Оказывается, существует прямая связь между химическими сигналами, присутствующими в старой крови, и утратой способности тканей к регенерации [ 1, 2, 3, 4 ]. Это, в большинстве случаев, сводит к нулю эффективность терапии с применением стволовых клеток в частности [ 5 ], и является одной из главных причин старения организма в целом. Следовательно, выявление и блокировка этих сигналов является важнейшей задачей антивозрастной терапии.

Угнетающее действие сыворотки крови старых людей и животных на рост клеток в культуре впервые было выявлено еще в 1921 году A. Carrel и A. H. Ebeling. Они показали, что рост культуры фибробластов цыплят зависит от возраста донора, сыворотку которого использовали для культуральной среды [ 6 ]. С тех пор с феноменом существования факторов старения, переносимых с кровью, сталкивалось большое количество исследователей. Так, например, японские авторы показали, что сыворотка крови старых людей способна подавлять пролиферацию Т-лимфоцитов in vitro. При использовании в качестве контролей сывороток пациентов с гепатомами, или сывороток беременных женщин, авторы установили, что факторы «старения», находящиеся в сыворотках старых людей, обладают уникальным механизмом супрессии пролиферации лимфоцитов, и, в отличие от других сывороток, способны неспецифически подавлять рост клеток на любом этапе активации [ 7 ]. Более того, в работе Бутенко Г. М. и др. было показано, что пациенты, сыворотка которых обладает выраженным ингибирующим действием в реакции бласттрансформации in vitro, имеют ограниченный срок жизни и умирают в течение ближайших 2-х лет с момента тестирования [ 8 ].

Подобный эффект был обнаружен на модели гетерохронного парабиоза − в эксперименте у молодых мышей, партнеров по парабиозу, появляются выраженные возрастные изменения иммунологических функций, которые прогрессируют по мере сосуществования животных, и которые, очевидно, передаются с кровью [ 9 ].

В 2010 году израильскими учеными было показано, что беременность стимулирует регенераторные возможности организма матери. Установлено, что у беременных самок мышей возрастом 10-12 месяцев скорость восстановления печени после гепатэктомии увеличивается вдвое, в то время как у молодых мышей скорость регенерации печени не зависит от наличия беременности [ 10 ]. Авторы предполагают, что при беременности в крови появляются факторы, способные тормозить процессы старения.

Целью данного исследования является выявление фактора, появление которого в кровотоке беременных самок способствует улучшению процессов регенерации и тормозит возникновение возрастных нарушений иммунной системы.

Задачи проекта: на модели гетерохронного парабиоза, которая представляет собой химеру из двух животных разного возраста, которые имеют общую кровеносную систему, изучить влияние беременности на возникновение возрастных изменений иммунной системы у партнеров разного возраста.

Дизайн 1-го этапа эксперимента:

1. Животные − мыши самки линии СВА/Са возрастом 3 мес (молодые), 10−12 мес (стареющие), 21−23 мес (старые).
   
2. Экспериментальная модель − создание парабиотических пар.
   
3. Экспериментальные группы:
   
   1. Проверка влияния беременности молодого партнера на процессы старения иммунной системы на модели гетерохронного парабиоза.
      

• Молодые изохронные пары − молодая мышь, сшитая с молодой ложнобеременной, 10 пар.
  
• Молодые изохронные пары − молодая мышь, сшитая с молодой беременной, 10 пар.
  
• Гетерохронные пары − молодая мышь, сшитая со старой, 10 пар.
  
• Гетерохронные пары − молодая беременная мышь, сшитая со старой, 10 пар.
  

1. Проверка влияния беременности стареющего партнера на процессы ускоренного старения иммунной системы у молодых партнеров по гетерохронному парабиозу.
   

• Гетерохронные пары − молодая мышь, сшитая со 10-12 мес ложнобеременной мышью, 10 пар.
  

• Гетерохронные пары − молодая мышь, сшитая со 10-12 мес беременной мышью, 10 пар.
  
• Стареющие изохронные пары − 10-12 мышь сшитая с 10-12 мес ложнобеременной мышью, 10 пар.
  

4. Схема проведения эксперимента:
   

4.1. Вазектомия самцов для обеспечения ложной беременности контрольных самок.

4.2. Проведение операций по созданию парабиотических пар.

4.3. Через 7 дней после проведения операций провести полноценное или ложное оплодотворение экспериментальных животных.

4.4. Через 15-20 дней после оплодотворения провести тестирование показателей состояния иммунной системы.

5. Тестируемые показатели:
   

5.1. Уровень прогестерона в плазме крови.

5.2. Визуальная проверка беременности (наличие плодов в матке, оценка предположительного срока).

5.3. Оценка состояния иммунной системы − проверка массы тимуса, пролиферативной активности спленоцитов, субпопуляционного состава Т-клеток селезенки.

5.4. Сбор и криосохранение плазмы крови экспериментальных животных.

Дизайн 2-го этапа эксперимента:

При всём существующем на сегодняшний день наборе методик идентификация регуляторных факторов процессов старения является довольно трудной задачей. Известно достаточно большое количество случаев, когда попытки идентификации регуляторных факторов не давали никаких результатов. Для решения подобных задач нами разработан и апробирован набор оригинальных методик, позволяющий находить комбинации управляющих сигналов, что делает возможным обнаружение химической природы регуляторных факторов.

Поиск факторов старения сыворотки крови предполагает широкий скрининг с оценкой суммарной ингибирующей активности тестируемой сыворотки на культурах клеток in vitro; а также последующих за этим этапах разделения сывороточных фракций с использованием различных методологических подходов: ультрацентрифугирование, хроматография, высаливание, диализ, электрофорез, обработка ДНКазами, РНКазами, протеазами, специфическими антителами. С последующим тестированием на культурах клеток in vitro с целью выявления фракций, обладающих максимальным ингибирующим или стимулирующим эффектом.

Еще один возможный подход − анализ факторов плаценты, обладающих эффектом «антистарения». Данный подход является более сложным для анализа, поскольку требует этапа разрушения клеток с последующим выделением биологически-активных фракций. Поскольку мы не знаем, к какому типу биологических молекул относятся активные факторы плаценты, достаточно сложно выбрать процедуру их экстракции. Поэтому, с нашей точки зрения, более логично начать с поиска факторов плазмы крови, которые появляются в крови беременных особей.

Выявление специфических факторов старения (или антистарения) организма позволит установить их структуру и разработать подходы к их нейтрализации в организме.

1. Анализ состава фракций плазмы крови, которые будут обладать ингибирующим или стимулирующим действием на рост и дифференцировку клеток in vitro. Разделение на плазмы на подфракции с использованием ультрацентрифугирования с использованием молекулярных фильтров. Обработка подфракций протеазами, ДНКазами, РНКазами, использование хроматографии, высаливания, диализа, электрофореза, и тестирование полученных подфракций на культурах клеток мыши in vitro. Основная цель фрагмента − выявить ключевую молекулу(ы), обладающую(ие) искомой биологической активностью.
   
2. Анализ структуры искомой молекулы с использованием масс-спектрометрии или других соответствующих подходов в зависимости от предполагаемой природы полученной субстанции.
   
3. Проверка эффекта введения полученной субстанции in vivo на животных.
   
4. Разработка подходов к блокированию (элиминации) предполагаемой субстанции в организме.
   

Бюджет исследования.

	Статьи расходов	1 этап	2 этап
	Зарплата	4000 грн	15000 грн
	Животные, корма, уход	6000 грн	4000 грн
	Проведение операций (наркоз, микрохирургический инструмент, постоперационный уход)	6000 грн	−
	Анализ иммунологических показателей экспериментальных животных (пластиковая посуда, среды, услуги проточного цитометра)	4000 грн	4000 грн
	Поддержание клеточных культур для анализа активности факторов сыворотки крови (культуральная посуда, среды, эмбриональная сыворотка, стерилизующие фильтры, культуральные добавки, и пр.)	−	20000 грн
	Фракционирование плазмы крови экспериментальных мышей (молекулярные ультрацентрифужные фильтры, расходные материалы для электрофореза, диализа, хроматографии, ферменты для установления природы искомой молекулы (ДНКазы, РНКазы, протеазы)).	−	20000 грн
	Анализ структуры искомой молекулы (услуги масс-спектрометра, секвенатора, аминокислотного анализатора)	−	10000 грн

Литература:

1. Conboy I.M., M.J. Conboy, A.J. Wagers, E.R. Girma, I.L. Weissman, T.A. Rando. Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment // Nature, Vol 433, 17 February 2005.
   
2. S.R. Mayack, J.L. Shadrach, F.S. Kim & A.J. Wagers. Systemic signals regulate ageing and rejuvenation of blood stem cell niches. Nature, Vol 463, 28 January 2010.
   
3. Hiroshi Kondo, Yumiko Yonezawa and Hideki Ito. Inhibitory Effects of Human Serum on Human Fetal Skin Fibroblast Migration: Migration-Inhibitory Activity and Substances in Serum, and Its Age-Related Changes In Vitro // Cellular & Developmental Biology. Animal Vol. 36, No. 4 (Apr., 2000), pp. 256-261.
   
4. Зуев В.А., Автандилов Г.Г., Игнатова Н.Г., Быковская С.И. Индуцированное старение мышей // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. – 2003. – Т. 136, № 3. – С. 286-287.
   

5. Dimmeler S., A. Leri. Aging and Disease as Modifiers of Efficacy of Cell Therapy // Circulation Research. 2008;102:1319-1330.

6. Carre, A., and Ebeling, A. H., J. Heterogenic serum, age, and multiplication fibroblasts // Exp. Med., 1921, xxxiv, 599.
   
7. Masato Tsujimoto, Tadaaki Tsuda, Masahiro Ohata. Mechanisms of Inhibitory Effect of Serum from Old Subjects on Lymphocyte Responsiveness to Mitogen // Japanese journal of geriatrics.− Vol.18 , No.5(1981)pp.361-369
   
8. Бутенко Г. М., Зайченко А. П. Использование иммунологических показателей для прогнозирования течения старения и болезней // Геронтология и гериатрия: Ежегодник. 1990: Превентивная геронтология и гериатрия, К., 1991. – С. 67-71.
   

9. Пишель И. Н., T. А. Дубилей, A. Е. Родниченко, Н. А. Утко, Ю. И. Леонов, С. А. Мигован, M. В. Азарскова, В. М. Kирик, Т. А. Бадова, О. А. Евтушенко, П. П. Kлименко, Н. Г. Ахаладзе, В. І. Варус, Х. К. Mурадян, Г. М. Бутенко. Прогрессивное снижение иммунологических функций при гетерохронном парабиозе: результаты предварительного исследования // Пробл. старения и долголетия. − 2008. − Т.17, № 2. − С. 164−173.

10. Y. Gielchinsky, N. Laufer, E. Weitman, et al. Pregnancy restores the regenerative capacity of the aged liver via activation of an mTORC1-controlled hyperplasia/hypertrophy switch // Genes Dev. 2010 24: 543-548