Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Рожина Эльвира Вячеславовна
ОСОБЕННОСТИ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА УГЛЕРОДА В СВЯЗИ С ИЗМЕНЕНИЕМ ИНТЕНСИВНОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ФОТОАССИМИЛЯТОВ В РАСТЕНИИ
03.01.05 - физиология и биохимия растений
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Уфа - 2012
Работа выполнена в лаборатории биофизики транспортных процессов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук (КИББ КазНЦ РАН) и в лаборатории гидробиологии Государственного бюджетного учреждения Института проблем экологии и недропользования академии наук республики Татарстан (ИПЭН АН РТ).
Научный руководитель: | доктор биологических наук, профессор Чиков Владимир Иванович, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук |
| Официальные оппоненты: | Доктор биологических наук, профессор Кудоярова Гюзель Радомесовна, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Уфимского научного центра Российской академии наук Доктор биологических наук Креславский Владимир Данилович, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук |
Ведущая организация: | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина |
Защита диссертации состоится 15 ноября 2012 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.013.11 в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении Высшего профессионального образования Башкирский государственный университет (БашГУ). Адрес: 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32, биологический факультет, ауд. 332. Факс (347)2736778; e-mail: disbiobsu@mail.ru. Официальный сайт БашГУ:
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БашГу.
Автореферат разослан 12 ноября 2012 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук Шарипова Марина Юрьевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Фотосинтезу принадлежит центральная роль в общей энергетике растительных и животных организмов, поскольку именно он служит первичным источником энергии для живых организмов. Известно (Чиков, 1987), что фотосинтетический метаболизм углерода (ФСМУ) быстро реагирует на изменения внешних условий. Несмотря на обилие публикаций, посвященных регуляции фотосинтеза (Мокроносов, 1981; Тихонов, 1999; Рубин, Кренделева, 2003; Zhu et al., 2008; Zhang et al., 2009; Stitt, 2010), вопрос взаимосвязи ФСМУ и транспорта продуктов фотосинтеза остается до конца не ясным. Не понятно, насколько тесно связано изменение ФСМУ на начальных этапах усвоения СО2 с экспортной функцией листа.
Фотосинтез играет ключевую роль в ассимиляции нитрата (Kim et al., 2002; Nunes-Nesi et al., 2010), в свою очередь, уровень азотного питания является одним из важнейших факторов, влияющих на физиологические процессы и продуктивность растения (Измайлов, 1986; Кретович, 1987; Paul, Foyer, 2001; Malamy, Ryan, 2001; Martin et al., 2002; Paul, Pellny, 2003; Stitt, 2007). Выявлено, что повышение уровня азотного питания приводит к задержке фотоассимилятов в листьях и разрастанию последних в ущерб хозяйственно важным органам (Тарчевский, Биктемиров, Иванова, 1973; Чиков, 1998). Показано, что такой эффект наблюдается только при действии нитратного азота (Chikov, Batasheva, 1999), но механизм такого действия не расшифрован. Исследования, объясняющие механизмы регулирования использования азота в сельскохозяйственных культурах, для повышения эффективности использования минеральных удобрений необходимы (Hirel et al., 2007; Kant et al., 2011), поскольку позволят снизить использование азотных удобрений и вред, наносимый нитратами окружающей среде.
Изучение особенностей фотосинтеза и транспорта ассимилятов в модельных условиях путем принудительного введения в побег растения раствора нитрата показало (Баташева и др. 2007), что изменение ФСМУ и транспорта ассимилятов под действием этого фактора было связано с постфотосинтетическими процессами. Была обнаружена специфическая динамика поступления 14С в сахарозу при введении в апопласт побега раствора нитрата. Однако отсутствуют данные, что такая динамика сахарозы имеет место в растениях in vivo. Не выяснен механизм, посредством которого реализуется действие нитратного иона, хотя и высказываются предположения об участии в данном процессе NO-сигнальной системы (Баташева и др., 2010; Хамидуллина и др., 2011). В свою очередь, установление некоторых эндогенных механизмов регуляции C/N баланса имеет ключевое значение для управления продукционными процессами.
Не менее важным является исследование начальных этапов переключения функций листа с донора на акцептор, происходящее при действии внешних факторов (нитратное питание, освещенность, уровень СО2) и выявление роли транспорта ассимилятов в этом процессе. В литературе имеются в основном данные о более поздних этапах изменения метаболизма, после изменение условий (Stitt et al., 2007, 2010), но неизвестно как быстро они реализуются.
Цель исследования: Целью настоящей работы является выяснение механизмов регуляции фотосинтеза при изменении интенсивности образования и экспорта ассимилятов из листьев.
Задачи исследования: 1. Выяснить особенности ФСМУ и динамики включения 14С в транспортный продукт фотосинтеза - сахарозу после корневых подкормок растений нитратным азотом. 2. Сравнить на растениях в модельных условиях и in vivo действие нитратного иона и генератора NO (нитропруссида натрия) на фотосинтез и транспорт ассимилятов. 3. Определить изменения ультраструктуры листа после введения в апопласт растения генератора NO (нитропруссида натрия). 4. Оценить состав и соотношение образующихся продуктов фотосинтеза, а также их последующий экспорт к потребляющим органам при внезапном изменении массы образующихся продуктов фотосинтеза (снижение освещенности и повышения концентрации СО2).
Положения, выносимые на защиту: 1)Динамика поступления 14С в сахарозу будет сходной для разных видов растений in vivо и in vitro, при влиянии нитратов. 2) Действие нитратов на фотосинтез, транспорт ассимилятоваи ультраструктуру листовой пластинки, вероятно, связано с образованием окиси азота. 3)аФотосинтетический метаболизм углерода в стационарном состоянии обеспечен соответствующим количеством ферментов, субстратов и кофакторов, которые продолжают аподдерживать его функционирование и при внезапном анарушении процесса. Если количество субстрата уменьшается, то аего метаболизация ускоряется, а избыточный субстрат метаболизирует через альтернативные пути.
Научная новизна работы. Показана общность кинетики поступления меченого углерода в сахарозу после ассимиляции 14СО2 in vivo и в модельных условиях. Впервые было установлено, что даже непродолжительное изменение массы образующихся продуктов фотосинтеза немедленно отражается на их дальнейшем экспорте из листа и распределении по растению. Уменьшение массы ассимилятов интенсифицирует их экспорт к потребляющим органам. Наоборот, увеличение количества первичных продуктов фотосинтеза приводит к задержке их в листе.
Впервые показано, что генератор NO - нитропруссид натрия, в концентрациях на 2-3 порядка меньших, чем нитрат, оказывает сходное с ним действие на фотосинтез, транспорт ассимилятов по растению и ультраструктуру клеток терминальной флоэмы листа льна-долгунца. Предложена схема участия NO-сигнальной системы в регуляции фотосинтеза и донорно-акцепторных взаимоотношений в растении.
Научно-практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований вносят вклад в понимание механизмов регуляции фотосинтеза и действия нитратного иона на отток ассимилятов из листовой пластинки. Предложенная идея участия NO-сигнальной системы в регуляции фотосинтеза и особой роли корневой системы в этих процессах позволяет наметить новые пути управления продукционным процессом растений, что может послужить основой для повышения эффективности использования азотных удобрений. Материалы диссертации могут быть использованы при чтении лекций по физиологии растений и для расширения теоретической базы применения минеральных удобрений (в частности, азотных) в сельском хозяйстве.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых Повышение эффективности растениеводства и животноводства - путь к рентабельному производству (Казань, 2008), Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов Симбиоз России-2008 с международным участием (Казань, 2008); XVI Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (Tampere, Finland, 2008); Международной конференции Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений (Екатеринбург, 2008); Международной конференции Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего Севера (Апатиты, 2009); IX Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета Материалы и технологии XXI века (Казань, 2009); итоговой конференции Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2010); 10th Nordic Photosynthesis Сongress (Tartu, Estonia, 2010), а также IV Региональной школе-конференции молодых ученых "Водная среда и природно-территориальные комплексы: исследование, использование, охрана" (ПетрГУ, Петрозаводск, 2011); на итоговой конференции ГБУ Института проблем экологии и недропользования АН РТ (Казань,2012).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 14 таблиц и 18 рисунков. Список литературы включает 263 источника.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1.ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1.1. Объект исследования. Исследования проводились на растениях яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Московская-35, на льне-долгунце (Linum usitatissimum L.) сорта Новоторжский, фасоли (Phaseolus vulgaris L.). Эти объекты относятся к видам с апопластной загрузкой флоэмы (Гамалей, 2004; 2007). Также проводились исследования на растении рогоз узколистный (Typha angustifolia L.) с симпластным типом загрузки ассимилятов.
Опыты проводились на вегетационной площадке Казанского института биохимии и биофизики. Растения выращивали в условиях вегетационного опыта в сосудах с воздушно сухой серой лесной почвой при оптимальных условиях влажности почвы (70% от полной влагоемкости) и естественной освещенности (400 - 700 нм ФАР). Измерение падающей световой энергии осуществлялось с помощью актинометра М-3 (СССР) и давало показания 440 Вт/м2 в день опыта. Исследования на рогозе проводили в условиях экспериментальных водоемов, включавших природную воду объемом 30 литров, с сопутствующими гидробионтами и куртинами представителя высшей водной растительности (ВВР) - рогоза узколистного, привезенных из озера Средний Кабан, расположенного на территории г. Казани республики Татарстан РФ. Все опыты проводили в 4-7 кратной биологической повторности. Полученные данные обрабатывали статистически (Лакин, 1990), в программе Statistica-06. В таблицах и рисунках представлены средние значения со стандартной ошибкой. В работе обсуждаются только показатели, различающиеся с достоверностью не менее 0.95. 1.2. Влияние разного возраста листа на постфотосинтетичское использование образующихся продуктов фотосинтеза. На растениях пшеницы, выращенных до репродуктивной фазы, исследовали образование продуктов фотосинтеза после 2-х минут ассимиляции 14СО2 верхним листом. Опыты проводили во время трубкования (молодой лист, в большой мере еще акцептор ассимилятов) и в период формирования зерновок, когда его экспортная функция резко возрастает (Чиков, Чемикосова и др., 1984). После фиксации 14СО2 судьба меченых продуктов фотосинтеза прослеживалась в течение 1, 3 часов. 1.3. Изучение действия почвенных азотных подкормок. Вегетирующие растения пшеницы и/или льна-долгунца подкармливали растворами мочевины или нитрата кальция, эквивалентными по содержанию азота (1г азота/сосуд), за 14-16 часов до начала эксперимента, то есть вечером предшествующего опыту дня (в 20:00). В день опыта (в период с 10 до 12 часов) донорный лист подкармливали 14СО2. Растения фасоли поливали нитратным раствором за неделю до подкормки 14СО2. После периода адаптации (две недели) в прикорневищную водную среду рогоза вводили раствор нитрата натрия в конечной концентрации 0,396 мМ или 3,96 мМ . 1.4. Введение в растения льна-долгунца и пшеницы экзогенных веществ. Для изменения состава апопластной жидкости в целый, срезанный под водой побег льна-долгунца длиной 50 см, с транспирационным током воды вводили различные растворы. При этом стебель опытного растения через специальное приспособление присоединяли к трубке, подающей в побег под давлением исследуемый раствор. На поверхности раствора в системе создавалось стабилизированное давление воздуха около 0.1 атм., которое соответствует величине корневого давления, т.к. известно, что величина сопротивления движению водного тока по ксилеме составляет 0.1 атм. на 1 м. пути при интенсивной транспирации (Сабинин, 1949). Таким образом, можно было поддерживать жизнеспособность срезанных растений в течение нескольких суток.
Введение экзогенных экспериментальных растворов на пшенице in vivo осуществлялось в подфлаговое колено соломины шприцем. Объем раствора составлял V=200 мкл. Соломина прокалывалась два раза, и через нижний прокол в полость вводился раствор. Использовали двойной контроль: в качестве первого контроля брали нативное растение, второго - растение, в которое вводили дистиллированную воду. Для экзогенного введения применяли растворы нитропруссида натрия в разной концентрации (50, 100 мкМ, 1 мМ), дистиллированную воду и раствор нитрата (50мМ). 1.5. Введение в растение 14СО2. Установка для фотосинтетического введения 14СО2 представляет собой замкнутую систему, состоящую из ряда элементов, соединённых газопроводами. В фотосинтетическую камеру помещали участок нативного листа растения (при изучении льна помещался участок стебля с несколькими донорными листами (до 10 шт.). Для пшеницы участок листа, помещённого в камеру, имел длину 3,5 см, что обеспечивало хороший фотосинтез этого участка. Концентрация углекислоты в камере составляла 0,03 объёмных процента. Удельная радиоактивность газовой фазы - 12 Мбк/л. Фотосинтетическая камера представляла собой термостатируемую листовую камеру-прищепку с мягкой резиновой прокладкой, аналогичную описанной (Оя, Расулов, 1981). Подача газовой смеси в камеру проводилась с помощью микрокомпрессора Wisa (Германия). Скорость потока воздуха через камеру составляла 90 л/ч, что не допускало перегрева растения. Время введения в лист 14СО2 составляло 1Ц2, 5 мин. 1.6. Изучение действия быстрого изменения фонда ассимилятов в растение на ФСМУ и транспорт ассимилятов. Объектом исследований служила яровая пшеница сорта Московская-35. Были использованы растения в репродуктивной стадии развития, когда экспортная функция листьев усиливается (Miller, 1992). Интенсивность образования продуктов фотосинтеза изучали с помощью 14СО2. У отдельных растений экспериментальные листья подкармливали 14СО2 при пониженной освещенности (110 Wm-2 - в четыре раза ниже естественной) или при повышенной концентрации СО2 (0,3%, при этом удельная радиоактивность углекислого газа в газгольдере была в три раза ниже). 1.7. Изучение распределения меченых ассимилятов по органам растения, хроматографический анализ фотоассимилятов. Исследование ассимиляции 14СО2 и распределение меченых продуктов фотосинтеза проводилось аналогично описанному в работе (Баташева, и др. 2007). 1.8. Анализ ультраструктуры листа. Анализ ультраструктуры листьев экспериментальных растений проводился совместно с Ф.А. Абдрахимовым. В апопласт растения льна-долгунца с транспирационным током воды вводили растворы SNP (50 мкМ, 100мкМ и 1мМ) и KNO3 (0.5%). Для электронно-микроскопического анализа через 1 час после начала введения раствора отсекали донорные листья и фиксировали их 2,5% глутаровым альдегидом в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2), при комнатной температуре в течение 12 ч, а затем 1% OsO4 в том же буфере с добавлением сахарозы (34 мг/мл) в течение 2 ч. Далее образцы дегидратировали в возрастающих концентрациях этанола (30, 40, 50, 60, 70, 96 %), ацетона и окиси пропилена. Образцы заливали эпоксидной смолой (Эпон-812, УServaФ, Германия). Полимеризовали в течение трех суток в термостате при температуре 37 С, 45 С и 60 С. Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-III (УLKBФ, Швеция), последовательно контрастировали 1,5% водным раствором уранилацетата при 60 С (30 мин.) и цитратом свинца при комнатной температуре (10 мин.). Препараты просматривали в электронном микроскопе Jem-1200 EX (Япония).
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Влияние почвенной подкормки азотными удобрениями на ФСМУ в листьях растений. Полученные С.Н. Баташевой с соавт. (2007) данные модельного опыта о прямом подавлении нитратами эвакуации продуктов фотосинтеза в растении льна долгунца побудили нас исследовать действие нитратного иона на экспорт ассимилятов из листьев in vivo. Кроме того, было важно проверить, нет ли видовых особенностей его проявления.
Модельные исследования ФСМУ, радиоавтографии листьев после ассимиляции 14СО2 и ультраструктуры клеток листьев после принудительного введения в срезанное растение льна-долгунца раствора нитрата с транспирационным током воды показали (Баташева и др., 2007; Абдрахимов и др., 2008), что торможение оттока сахарозы, вероятно, происходит на этапе ее движения по флоэме. Мы провели сходные опыты с нативными растениями пшеницы, фасоли и изучили постфотосинтетическое распределение меченого углерода среди низкомолекулярных продуктов фотосинтеза в растениях после почвенной подкормки азотными (нитратами или мочевиной) удобрениями.
На рис. 1 представлена динамика поступления метки в сахарозу в единицах радиоактивности (кБк) после ассимиляции листом 14СО2 у растений пшеницы, политых растворами нитратов (50 мМ), мочевины или водой (контроль). В процессе 3-х мин ассимиляции 14СО2 включение 14С в сахарозу, отражающее интенсивность ее образования, было больше всего в контроле. Через 30 мин значения этих показателей у всех вариантов сблизились. Однако за период с 30 мин до 22 часов в контроле и в варианте мочевина радиоактивность сахарозы уменьшилась в 11,5 и 10,1 раза, соответственно, а у нитратных - только в 2,6 раза. Эти данные напрямую свидетельствуют о торможении оттока сахарозы из листьев нитратных вариантов на этапе их транспорта после выхода из мезофилла в листе растения пшеницы.
Рисунок 1. Влияние азотной подкормки на динамику содержания 14С в сахарозе (kBq) во флаг-листе пшеницы после 2,5 мин ассимиляции 14СО2
Сходные результаты были получены и на нативных растениях фасоли, политых растворами нитратов (50 мМ) за 7 дней до эксперимента.
Таким образом, характерная особенность динамики поступления 14С в сахарозу после подкормки растений нитратными удобрениями также отмечается на растениях пшеницы и фасоли in vivo. Это позволяет предполагать наличие универсального для растений механизма действия нитратного иона на ФСМУ и транспорт фотоассимилятов и переключении функций с листа-донора на лист-акцептор, при нарушении эвакуации фотосинтатов. Этот вывод подтверждается и данными по рогозу, а также работой Хамидуллина и др. (2011), из которых видно, что такая же реакция на введение нитратов наблюдается и у симпластных растений.
2.2. Особенности ФСМУ у листа-донора и листа-акцептора. Развитие листа растения в онтогенезе служит естественной моделью его функционального перехода из акцептора в доноры фотоассимилятов. Мы проанализировали распределение 14С среди продуктов фотосинтеза во флаг-листьях пшеницы in vivo разного онтогенетического состояния (растущих - у растений, находящихся в фазе трубкования, и завершивших рост - у растений в фазе формирования зерновки), сразу или через 1 час после 2-х минутной фиксации 14СО2 этими листьями.
Таблица 1
Постфотосинтетическая метаболизация меченых растворимых продуктов фотосинтеза растущими (фаза трубкования) листьями пшеницы (кБк) через 1 час после 2-х минутной ассимиляции 14СО2
Содержание 14С (кБк) | 2 мин в 14СО2 | Через 1 час | % от 2-х мин |
ист-донор | 2059 75 | 1946 151 | 94,5 |
Убыль 14С из листа-донора | - | 113 | 5,5 |
Содержание 14С в соединениях: | |||
Сахароза | 1042 36 | 1767 60 | 170,0 |
Гексозы | 107 6 | 27 2 | 25,0 |
ФЭС | 177 20 | 12 0,0 | 6,8 |
Продукты гликолатного пути | 325 16 | 10 0,0 | 3,1 |
Аланин | 198 16 | 10 0,0 | 5,0 |
Малат + аспартат | 68 8 | 35 2 | 51,0 |
Пигменты | 25 2 | 12 0,0 | 48,0 |
Прочие | 115 8 | 86 9 | 75,0 |
У молодых листьев (табл. 1) интенсивность фиксации 14СО2 несколько ниже, чем у зрелых листьев-экспортеров (табл. 2), а радиоактивность листа меньше изменяется в последующие 60 мин. Потери меченого углерода за этот период составляют всего 5,5%, что объясняется, по-видимому, прежде всего небольшой экспортной функцией листа.
Первоначально с помощью глицеральдегидфосфатдегидрогеназы ФГК в основном используется в восстановительной реакции с образованием фосфорных эфиров сахаров (ФЭС). 14С-углерод, содержащийся в ФЭС, гексозах, продуктах гликолатного пути и аланине, в постфотосинтетический период (60 мин.) в большей степени исчезает и сосредотачивается в сахарозе, которая при этом меньше экспортируется. Содержание 14С в других соединениях, таких как малат, аспартат и пигменты, также снижается, но это происходит в меньшей степени. Увеличение включения 14С в четырехуглеродные соединения (малат, аспартат) у растущих листьев по сравнению со зрелыми (табл. 2), свидетельствует о повышенной у них активности ФЕП-карбоксилазной реакции. В результате, ФГК больше используется для образования ФЕП, и повышается фиксация 14СО2 по типу темновой реакции, ФЕП может использоваться в реакции переаминирования или прямого аминирования с образованием аланина (Чиков, 1987).
По мере роста листа и формирования его роли как источника ассимилятов для других органов и тканей возрастала общая и относительная интенсивность образования сахарозы (табл. 2)
Таблица 2
Постфотосинтетическая метаболизация меченых растворимых продуктов фотосинтеза зрелыми листьями-донорами (фаза формирования зерновок) пшеницы (кБк) через 1 час после 2-х минутной ассимиляции 14СО2
Содержание 14С (кБк) | 2 мин в 14СО2 | Через 1 час | % от 2-х мин |
ист-донор | 2134 94 | 1404 122 | 65,8 |
Убыль 14С из листа-донора | - | 730 | 34,2 |
Содержание 14С в соединениях: | |||
Сахароза | 1152 34 | 1245 59 | 108,0 |
Гексозы | 96 12 | 32 1 | 33,0 |
ФЭС | 66 16 | 6,0 | 9,0 |
Продукты гликолатного пути | 284 14 | 7 0,0 | 2,5 |
Аланин | 262 38 | 15,2 | 6,0 |
Малат + аспартат | 42 4 | 11 2 | 25,0 |
Пигменты | 17 2 | 11 2 | 64,7 |
Прочие | 147 9 | 80 8 | 54,0 |
Зрелый лист уже через 1 час экспортирует порядка 1/3 образовавшихся в нем 14С-ассимилятов. Происходит это за счет транспортного продукта - сахарозы (Курсанов, 1984). В результате, если в молодом листе содержание 14С-углерода в сахарозе за час после фиксации 14СО2 увеличивается на 70% (табл. 1), то в зрелом листе (за счет активного экспорта) только на 8%. Таким образом, у листьев-доноров наблюдается интенсивный экспорт сахарозы из листа в ближайшие 60 мин после поглощения 14СО2.
2.3. Метаболизация меченых продуктов фотосинтеза in vivo в течение ближайших 60 минут после ассимиляции 14СО2 листьями при изменении массы образующихся ассимилятов. Известно, что фотосинтез немедленно реагирует на изменения многих факторов (освещение, температуру, концентрацию СО2, и др.). Однако непонятно, в какой степени эти изменения в дальнейшем сказываются на использовании образовавшихся продуктов в растении. В модельных условиях при введении в побег растворов нитратов изменение распределения 14С среди продуктов фотосинтеза происходило уже через 30 минут (Баташева, 2007). Поэтому нам представлялось интересным оценить степень изменения синтеза и метаболизации отдельных первичных продуктов фотосинтеза в течение ближайших 60 минут после поглощения 14СО2, при разной массе образующихся ассимилятов в листе. 2.3.1. Влияние повышения концентрации СО2 и снижения освещенности на последующее использование меченых ассимилятов в растениях пшеницы. Известно, что наиболее непосредственное действие на фотосинтез оказывают такие факторы, как освещенность и концентрация углекислого газа (Zhu et al., 2008). Это самые естественные и постоянно меняющиеся в природе факторы, которые среди прочего влияют и на отношения между донорами и акцепторами ассимилятов в растении (ДАО) (Stitt et al., 1983, Platt et al., 1977). В свою очередь, изменение ДАО, нарушение оттока продуктов фотоассимиляции из листа может приводить к изменению функциональной роли последнего. Нарушение ДАО может происходить при изменении массы образующихся ассимилятов в листе в результате изменившихся условий, причем изменения последних могут быть кратковременными. Такие факторы окружающей среды, как освещенность и концентрация СО2 регулируют активность Рубиско, изменяя концентрацию компетентных реакционных центров и их активность (Вийль, 2002), Рубиско никогда не проявляет своей максимальной активности. При концентрации СО2, которая насыщает фотосинтез, верхний предел скорости карбоксилирования определяется синтезом субстрата Ч рибулозо-бисфосфата (Вийль и др., 2001). Есть основания полагать, что при резком изменении количества и соотношения различных продуктов фотосинтеза, дальнейшая судьба этих продуктов будет разная, в том числе и их экспорт из листа.
Увеличение концентрации СО2 влечет за собой не только уменьшение количества углерода, проходящего через гликолатный путь (Чиков, 1987), но и снижает отчуждение ФГК в альтернативные неуглеводные пути биосинтеза (аланин, серин) и резко усиливает углеводную направленность синтеза (Мокроносов, 1981), что совпадает с постфотосинтетическими изменениями, происходящими в зрелом листе, доноре ассимилятов. Однако процесс загрузки образующейся массы сахарозы во флоэму, по-видимому, не справляется и относительно ее экспорт снижается (рис. 2).
Рисунок 2. Влияние изменения освещенности или концентрации СО2 (в момент фиксации 14СО2) на последующее распределение меченых ассимилятов из флаг-листа по органам пшеницы через 1 час после 1 мин. фиксации 14СО2
Обозначения: 1-14C-лист-донор, 2- влагалище 14C-листа-донора, 3-стебель, 4-колос.
Понижение освещенности, напротив, снижает интенсивность ассимиляции СО2. В результате создается дефицит продуктов фотосинтеза, необходимых для экспорта из листа и ассимиляты более успешно эвакуируются из листа. Такие воздействия позволили в наших опытах создавать большее различие (более чем в два раза) массы образовавшихся в листе ассимилятов. Выбранный интервал пост-фотосинтетического периода 60 мин. позволял возникшему новому пулу ассимилятов (в одном случае уменьшенному, а в другом - увеличенному) достичь конечного пункта транспорта ассимилятов (у пшеницы - колоса) в разной степени (рис. 2). Такие изменения в листе отразились и на распределении меченых ассимилятов по органам растения (рис. 2). Снижение освещенности увеличило поступление меченых ассимилятов в колос в 2,7 раза, а повышение концентрации СО2 - уменьшило в 3 раза.
Полученные данные свидетельствую о том, что в каждый отдельно взятый момент в растении складывается определенный уровень потока ассимилятов из каждого листа к акцепторам. Стабильность этого потока обеспечивается соответствующей активностью и количеством ферментов. Любое, даже временное изменение массы образовавшихся ассимилятов оказывается в противоречии с интенсивностью этого потока. И происходит коррекция экспортной функции листа. В результате происходит некоторое (в пределах возможности системы) демпфирование интенсивности потока ассимилятов от донора к акцептору. Это, по-видимому, быстрая (мобильная) регуляция фотосинтеза и транспорта. При более глубоком нарушении должен срабатывать иной уровень регуляции, затрагивающий уже более широкий перечень механизмов с включением и других тканей растения, как в листе, так и в органах-акцепторах.
2.4. Влияние генератора NO (sodium nitroprusside-SNP) на фотосинтез, отток ассимилятов и ультраструктуру листа. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что модуляция транспортных процессов листа факторами различной природы (температура, осмотики, затенение и т.д.) сопряжена с существенными ультраструктурными изменениями клеток проводящей системы, как симпластных, так и апопластных растений (Гамалей, Пахомова, 1981; Гамалей 2004, 2007). По морфологическим признакам терминали флоэмных пучков растение льна-долгунца (сем. Linaceae, пор. Geraniales) относятся к апопластному продвинутому (2В) типу (Гамалей, 2004).
Для проверки участия NO при действии нитратного иона было исследовано действие нитропруссида натрия (SNP - донор окиси азота) в разных концентрациях на фотосинтез и транспорт фотоассимилятов и ультраструктуру листовых пластин льна-долгунца (модельные условия) и in vivo.
Введение в апопласт SNP приводило к снижению ассимиляции 14СО2 до 75%. Столь резкое уменьшение поглощения углекислого газа с повышением концентрации до 1 мM частично можно объяснить участием NO в закрывании устьиц (Mata et al., 2001; Глянько, 2009). Показано, что NO, принимающий участие в устьичных движениях, может образовываться из нитрат-аниона при участии фермента нитратредуктазы (Desikan et al., 2002). Следует отметить, что подавление фотосинтеза нитропруссидом в концентрации 1 мM было значительно большим, чем нитратами в концентрации 50 мM. Это позволяет предполагать ингибирующее действие SNP в высоких концентрациях.
Таблица 3
Влияние нитропруссида натрия на распределение 14С среди продуктов 3-х мин. фотосинтеза льна-долгунца (в % от спирто-водорастворимой фракции)
Соединения | Контроль (Н2О) | Нитропруссид натрия (1 mM) |
Сахароза | 48,0 3,9 | 33,6 1,1 |
Гексозы | 5,5 0,9 | 10,1 1,9 |
Серин+глицин+гликолат | 0,7 0,2 | 4,1 0,4 |
Аминокислоты | 22,0 1,7 | 23,3 1,8 |
Олигосахара | 3,5 0,9 | 6,2 1,2 |
Пигменты | 2,6 0,5 | 3,1 0,7 |
Прочие | 17,7 | 19,6 |
Отношение: сахароза/олигосахара | 14,5 | 5,4 |
Сахароза/гексозы | 9,1 | 3,3 |
Обработка SNP приводила к изменению фотосинтетического углеродного метаболизма. Анализ распределения 14С среди меченых продуктов фотосинтеза показал, что наибольшие относительные изменения произошли в группе сахаров (табл. 3). Как и в случае с принудительным введением в апопласт нитратов (Баташева и др., 2007), снижалась доля 14С в сахарозе, что приводило к пониженному отношению меченых сахароза/гексозы. Повышенное содержание моносахаров относительно усилило образование других запасных сахаров (олигосахаридов). В результате отношение сахароза/олигосахара уменьшилось почти в 3 раза.
Введение SNP относительно снижало экспорт меченых фотоассимилятов из донорной части побега. Известно (Neill, 2003), что действие донора NO может иметь противоположный эффект в зависимости от концентрации.
Рисунок 3. Влияние SNP на распределение 14С-ассимилятов по растению льна-долгунца (% от экспортированного 14С).
У опытных растений (рис. 3) затормаживался отток меченых ассимилятов из донорного участка побега, и увеличивался их транспорт в верхнюю часть побега. Если в контроле основная часть экспортированных ассимилятов оказывалась в нижней части побега, то после введения нитропруссида не зависимо от концентрации характер распределения изменялся: 14С-ассимиляты находились в верхней части побега. Сходные изменения в распределении меченых ассимилятов по растению льна-долгунца наблюдались и при введении в побег нитрата калия (Баташева и др., 2007), но только при более высокой концентрации.
Введение в побег донора NO приводило к существенным изменениям в организации как ассимилирующих клеток, так и клеток проводящей системы листа (рис. 4, А-Е). Фотосинтезирующие клетки мезофилла контрольных растений характеризовались хлоропластами с хорошо развитой системой фотосинтетических мембран и многочисленными крахмальными зернами, а также овальными ортодоксальными митохондриями и крупными пероксисомами (рис. 4, Б). В терминальных пучках листовых пластинок льна-долгунца, растения с апопластным способом загрузки, флоэмные элементы ассоциированы с клетками-спутниками закрытого типа (transfer cells). Апопластный лабиринт последних был хорошо развит, клетки вакуолизированы слабо, а цитоплазма обильно насыщена рибосомами и митохондриями. Митохондрии были умеренно конденсированы и содержали многочисленные кристы (рис. 4, А).
Через 30 мин. после начала введения в апопласт нитропруссида натрия (1 мМ) структурные изменения были очевидны (рис. 4, В-Е). Они выразились в вакуолизации клеток-спутников с образованием в них центральной вакуоли (рис. 4, В, Г). Вершины гребней лабиринта клеточных стенок становились осмиофильными и часто достигали полости вакуоли (рис. 4, В). Структурные изменения домена (ассимилирующая клеткаЦклетка спутникЦситовидный элемент) выразились в просветлении матрикса митохондрий (место декарбоксилирования глицина) и закручивании диктиосом в кольцевые структуры (рис. 4, Г, Д). NO индуцировал образование в ассимилирующих клетках многочисленных мультимембранных и мультивезикулярных структур (рис. 4, Е).
Анализ структурных изменений выявил, что они во многом аналогичны тем, что наблюдались через 30 мин. после начала введения в апопласт солей нитратов (Абдрахимов, 2008). Схожие эффекты обнаруживались при торможении транспорта фотоассимилятов путем наложения на черешок листа ледяной манжеты (Гамалей и др., 2000). Поскольку в последнем случае первопричиной наблюдаемых изменений является замедление движения сахаров по флоэме, можно предположить, что продукт неполного восстановления нитратов - NO - способен ингибировать транспорт ассимилятов непосредственно в клетках флоэмы. В пользу этого предположения свидетельствует способность NO повышать в листе количество каллозы - -1,3-глюкана, участвующего также в закупоривании пор ситовидных пластинок (Paris, 2007). Кроме каллозы, в затыкании пор может принимать участие Р-белок флоэмы, который существует в различных формах (Knoblauch et al., 1998). Появление везикул внутри вакуоли вследствие эндоцитоза может свидетельствовать о повышении осмотичности окружающей клетку среды, что может быть следствием накопления сахаров в апопласте листа при торможении экспорта сахаров по флоэме.
Таким образом, триггером происходящих изменений в клетках листовой пластинки, при введении в апопласт солей нитрата с транспирационным током воды, может быть образование окиси азота, поскольку обнаружено большое сходство в реакции изменения ФСМУ, распределении фотосинтатов по различным частям растения и динамики изменений ультраструктуры клеток, как при введении нитрата калия, так и при введении донора NO.
Рисунок 4. Влияние NO (1 мМ) на ультратонкую организацию клеток мезофилла листовых пластинок льна-долгунца.
В - вакуоль, Д - диктиосома, КСФ - клетка спутник флоэмы, КФП - клетка флоэмной паренхимы, М - митохондрия, ПО - паренхимная обкладка.
Поскольку при торможении оттока продуктов фотосинтеза из листа (как в условиях in vitro, так и в нативных растениях) наблюдается сходная динамика включения метки в сахарозу - накопление 14С в этом соединении в течение ближайших 30-60 мин., было решено проверить, как быстро влияет изменение количества образовавшихся ассимилятов на их судьбу в этот период. Возможность накопления конечных продуктов фотосинтеза во флоэмных окончаниях листа может являться важным элементом регуляции фотосинтеза в системе целого растения, так как благодаря этому создается буферная емкость транспортных веществ между фотосинтезом и использованием ассимилятов. Демпфирование системы донорно-акцепторных отношений должна повышать ее надежность.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные в данной работе результаты показали, что в стационарных условиях формируется определенный уровень образования и экспорта транспортного продукта фотосинтеза - сахарозы. Если по каким-либо причинам ассимиляция СО2 возрастает, то возникшее дополнительное количество сахарозы не может (по крайней мере, первое время) экспортироваться из листа, а ее предшественники (фосфаты сахаров) накапливаются в хлоропластах, препятствуя восстановлению ФГК. Образующийся избыток ФГК метаболизирует по невосстановительному пути с образованием аланина. Избыток образовавшегося аланина, вероятно, экспортируется по флоэме, меняя состав флоэмного экссудата (Курсанов, 1976). Последнее может спровоцировать перестройку метаболизма в органах-акцепторах и в самом листе-доноре, который начинает проявлять себя листом-акцептором.
Наоборот, снижение образования сахаров (при снижении освещения), в том числе и транспортного продукта - сахарозы - интенсифицирует транспорт последней. Интенсивность потребления ассимилятов в органах-акцепторах оказывается выше, чем экспортируется по флоэме, и загрузка сахарозы в сопровождающие флоэмные окончания из мезофилла облегчается.
Сходство в действии нитратного иона на ФСМУ, транспорт ассимилятов по растению и динамику поступления 14С в сахарозу в опытах in vivo и in vitro показывает, что важные события по формированию эффекта торможения оттока ассимилятов из листа, по-видимому, развиваются в проводящей системе флоэмы. В проявление этого процесса, в определенной мере, вмешивается активированный азотом метаболизм отдельных нефотосинтезирующих тканей. Например, повышенная активность корневой системы, связанная с поглощением нитратов, вызывает дополнительный приток ассимилятов к корням, что на начальном этапе снижает эффект торможения нитратами оттока ассимилятов из листьев. Встреча потока ассимилятов и новой порции нитратов происходит в корнях, и в первое время с их дополнительно поступившим количеством восстановительные системы, вероятно, справляются.
Таким образом, в растении имеет место связь двух главнейших по массе потоков веществ - сахаров фотосинтетического происхождения и нитратов. Несомненно, между этими потоками существует регуляторное взаимодействие, природа которого пока не ясна (рис. 5) - Х2. Обнаруженная нами аналогия действия нитропруссида натрия в каталитических концентрациях и нитрата в субстратных количествах позволяют заключить, что NO-сигнальная система, по-видимому, участвует в запуске процессов перестройки метаболизма растения, приводящих к торможению оттока ассимилятов и возбуждению ростовых процессов в листе.
Если NO появляется в корнях, то его действие, как сигнальной молекулы, распространяется только на тканях корневой системы, способствуя образованию новой зоны поглощения минеральных веществ (в том числе и нитратов). Оно проявляется как активация роста всасывающей части корневой системы. Это хорошо продемонстрировано в монографии Трапезникова, Иванова, Тальвинской (1999). Дальнейшее усиленное поступление нитратов в корни оказывается уже за пределами возможностей восстановительной системы корней и он начинает поступать в надземную часть растения.
При нитратном питании растений и любом воздействии, приводящем к изменению апопластного пула сахарозы, увеличивается, вероятно, ее гидролиз. Сахароза, образующаяся в клетках мезофилла, поступает в проводящую систему листа, где, под действием NO, вероятно, образуется каллоза (Paris et al., 2007), препятствующая оттоку фотоассимилятов. В возникающей закупорке пор флоэмы может принимать участие Р-белок (Stitt et al., 2002).
В результате возникает торможение оттока сахарозы и ее накопление в апопласте, где она гидролизуется апопластной инвертазой до гексоз. Последние вынуждены возвращаться в фотосинтезирующие клетки (где могут использоваться как на биосинтетические процессы, так и на синтез сахарозы), именно в этих условиях лист-донор начинает вести себя как акцептор ассимилятов. Гексозы также влияют и на экспрессию генов (Sheen et al., 1999). В результате поступление фотоассимилятов в акцептирующие органы изменяется, в том числе и в корни, а изменение ДАО, в свою очередь, ведет к перестройке ФСМУ.
Рисунок 5. Модель эндогенной регуляции фотосинтеза в целом растении (Мокроносов, 1983 с добавлениями).
А - аттрагирующие центры; Б - скорость ростовых процессов или поглощения минеральных веществ корнями; В - метаболические пулы продуктов фотосинтеза; Г - система транспорта продуктов фотосинтеза; Д - контрольный уровень продуктов фотосинтеза в фотосинтетическом аппарате; Е - фотосинтетический канал; Ж - система репрессии или индукции ферментов фотосинтеза; З - зона временного депонирования ассимилятов; И - фотоокисление продуктов фотосинтеза; Ф - обобществленный апопластный фонд ассимилятов, служащий сигналом изменения ДАО; Х1 - система распределения ассимилятов между разными потребителями; Х2 - механизм регуляции взаимодействия потоков продуктов фотосинтеза и нитратов.
Таким образом, можно предположить, что сигналы от азота и углерода сходятся на уровне гидролиза сахаров в апопласте под действием нитрата. Обобществленный пул сахаров (возникший в результате разных причин) в апопластном пространстве (концентрация, состав сахаров и др.), возможно, является сигналом (Чиков, 2008) для регуляции метаболизма при изменении ДАО.
ВЫВОДЫ
- Установлено большое сходство действия нитрата в растениях in vitro и in vivo на динамику поступления 14С в сахарозу и распределение ассимилятов по органам растения. Эта динамика изменяется как в онтогенезе, так и при действии нитратов.
- Впервые в модельных условиях и in vivo на льне-долгунце показано, что генератор NO нитропруссид натрия в концентрациях на 2-3 порядка меньших, чем нитрат, оказывает сходное с ним действие на изменение фотосинтетического метаболизма углерода и транспорт ассимилятов по растению.
- Введение в апопласт нитропруссида натрия (50, 100 мкМ и 1 мМ) вызывает сходное с нитратами действие на ультраструктуру клеток терминальной флоэмы листа льна-долгунца. На целых растениях in vivo показано, что генератор NO тормозит отток ассимилятов из листьев и снижает их нисходящий транспорт.
- Впервые выявлено, что даже непродолжительное изменение массы образующихся продуктов фотосинтеза отражается на их дальнейшем экспорте из листа. Внезапное уменьшение массы ассимилятов немедленно интенсифицирует их экспорт к потребляющим органам. Наоборот, увеличение количества первичных продуктов фотосинтеза приводит к задержке их в листе и усилению их использования во внутриклеточных процессах.
Публикации по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ
1. Баташева С.Н., Абдрахимов Ф.А., Бакирова Г.Г., Исаева Э.В., Чиков В.И. Влияние донора оксида азота - нитропруссида натрия - на фотосинтез и ультраструктуру листовых пластинок льна-долгунца // Физиология растений. 2010. Т. 57. № 3. С. 398-403.
2. Batasheva S.N., Isaeva E.V., Chikov V.I., Ratushnyk A.A. The Influence of Suddenly Changing Quantity of Produced Photosynthetic Products on its Export from Donor-Leave // Middle-East Journal of Scientific Research. 2011. I. 10. № 2. P. 188-190.
3. Chikov V.I., Isaeva E.V., Ratushnyk A.A., Tarasov O.Y., Abramova K.I., Trushin M.V. Changes of photosynthesis and carbon metabolism in Typha angustifolia L. grown in conditions of nitrate nitrogen overload // Acta Botanica Croatica. 2012. I. 71. № 2. P. 1Ц7.
Публикации в сборниках и материалах всероссийских и международных конференций
4. Исаева Э.В., Баташева С.Н. Постфотосинтетическое превращение меченых продуктов фотосинтеза у пшеницы // Повышение эффективности растениеводства и животноводства - путь к рентабельному производству: Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных, посвящённой памяти Р.Г. Гареева (Казань, 6-7 февраля 2008 г.). Казань: Изд-во Фолиантъ, 2008. С. 126-130.
5. Исаева Э.В., Баташева С.Н. Влияние внезапно изменившейся массы продуктов фотосинтеза на экспорт ассимилятов из листа и их распределение по органам растения пшеницы // Биология: традиции и инновации в ХХI веке. Симбиоз-Россия-2008: Материалы I Всероссийского конгресса студентов и аспирантов-биологов с межд. Участием (Казань, 6-10 июля 2008 г.). Казань: Изд-во Казанск. Гос. Ун-та, 2008. С. 52-54.
6. Исаева Э.В., Баташева С.Н., Хамидуллина Л.А., Саляхова Г.А., Чиков В.И. Изменение фотосинтетического метаболизма углерода под действием донора (NO) нитропруссида натрия // Становление и достижения биохимической школы КУ. Сборник материалов конференции, посвященной памяти В.Г. Винтера (Казань, 12 ноября 2009 г.). Казань: Изд-во Казанского государственного университета, 2009. С. 61-62.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии