Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
МОРОЗКИН ЕВГЕНИЙ СЕРГЕЕВИЧ
МЕХАНИЗМЫ ГЕНЕРАЦИИ И СОСТАВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ДНК В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
03.01.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
Новосибирск - 2012
Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
Научный консультант:
к.б.н. Лактионов Павел Петрович
Официальные оппоненты:
Годовикова Татьяна Сергеевна, д.х.н., доцент Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, в.н.с.
Таранин Александр Владимирович, д.б.н.
Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, зав. лабораторией.
Ведущая организация:
Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН
Защита состоится л 26 декабря 2012 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 6300Новосибирск, проспект академика Лаврентьева,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Автореферат разослан л 20 ноября 2012 г.
Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент Коваль В. В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Тот факт, что дезоксирибонуклеиновые кислоты постоянно присутствуют во внеклеточной среде культивируемых клеток in vitro, а также в биологических жидкостях и в межклеточном пространстве in vivo в настоящее время не вызывает сомнений. Показано, что внеклеточные ДНК (внДНК) имеют в основном эндогенное происхождение, стабильны в течение длительного времени, переносятся током крови и лимфы и могут быть обнаружены далеко от места локализации родительских клеток.
Перечисленные факты позволяют использовать внДНК как источник диагностического материала для выявления специфических маркеров заболеваний, связанных с нарушением функций генетического аппарата клеток, в частности онкологических заболеваний. Определенный успех исследователей в поиске ДНК-маркеров онкологических заболеваний привел к тому, что кровь или плазму крови стали называть Ужидкой биопсиейФ, так как анализ внДНК крови позволил с определенной чувствительностью и специфичностью не только диагностировать опухоль, но и определять тканевую принадлежность заболевания.
Однако, несмотря на то, что эта область интенсивно развивается, на рынке медицинских аналитических систем до сих пор нет аккредитованных FDA диагностических методов, основанных на анализе внДНК. Анализ неудач, показал, что наряду с очевидными факторами, такими как несовершенство используемых подходов, недостаточная чувствительность аналитических систем, отсутствие межлабораторных стандартов и несовпадение данных, полученных разными группами исследователей, выявляются более серьезные факторы, такие как несовпадение структуры и частот встречаемости ДНК-онкомаркеров в ткани и крови. Недостаток фундаментальных знаний о природе внДНК и процессах, обеспечивающих их генерацию, циркуляцию и выведение из кровотока не позволяет объяснить вышеперечисленные факты и, в конечном счете, осуществлять рациональный поиск циркулирующих ДНК-онкомаркеров для ранней малоинвазивной диагностики рака.
Во внеклеточной среде высших эукариот внДНК могут появляться в результате процессов клеточной смерти (апоптоз и некроз), а также по данным ряда авторов в результате секреции нуклеиновых кислот клетками и внеклеточного синтеза. Однако данные о секреции ДНК клетками и внеклеточном синтезе ДНК были получены более 30 лет назад и в настоящее время не представляются достаточно убедительными и требуют проверки с использованием современных молекулярно-биологических подходов. В отличие от механизмов активной секреции ДНК клетками, механизмы индукции и развития апоптоза изучены достаточно глубоко. Тем не менее, в контексте генерации внДНК ряд вопросов, принципиальных для понимания фундаментальных основ формирования пула внДНК, остаются открытыми. В частности, мало изученным остается алгоритм гидролиза различных участков хромосом при помощи апоптотических нуклеаз, который может определять относительную представленность последовательностей внДНК. Решение этих вопросов позволило бы не только оптимизировать поиск мишеней для диагностических методов, но и значительно продвинуться в изучении механизмов, участвующих в генерации внДНК и реализации их функций.
Целью работы являлось выявление клеточных механизмов, обеспечивающих генерацию внеклеточной ДНК, а также исследование влияния этих механизмов на состав последовательностей внеклеточной ДНК.
В ходе исследования решались следующие задачи:
Исследовать влияние индукторов и ингибиторов активной секреции и апоптоза на концентрацию внеклеточной ДНК в культурах клеток человека.
Исследовать возможность синтеза ДНК вне клеток человека.
Выявить отличия в представленности последовательностей между внеклеточной и геномной ДНК с помощью флуоресцентной гибридизации in situ с последующим клонированием и секвенированием выявленных районов хромосом.
Научная новизна и практическая ценность работы. В рамках первой части работы впервые было проведено комплексное исследование возможных механизмов генерации внДНК в культурах первичных эндотелиоцитов, фибробластов и клеток линии HeLa. При помощи индукции/ингибирования Гольджи-зависимого и Гольджи-независимых путей секреции белков было показано, что процессы активной секреции не участвуют в генерации внДНК. При помощи инкубации клеток с биотинилированным аналогом dUTP и последующим ПЦР анализом аффинно выделенной биотинилированной внДНК опровергнута гипотеза о возможности синтеза ДНК вне клеток. Показано, что внеклеточный синтез ДНК наблюдается только в культурах клеток, инфицированных микоплазмой. При помощи индукции/ингибирования апоптоза было показано, что основным источником внДНК в культуре клеток, культивируемых в нормальных условиях, является апоптоз. Во второй части работы был исследован состав последовательностей внДНК, генерируемых в результате апоптоза, с помощью флуоресцентной гибридизации in situ. В результате проведения двухцветной флуоресцентной гибридизации in situ было обнаружено, что внДНК отличается по составу последовательностей от геномной ДНК. Отличия в представленности были обнаружены в составе прицентромерного района хромосомы 9, а также дистальных плечей акроцентрических хромосом. В результате микродиссекции флуоресцентно меченых зондов, гибридизующихся в районе 9q12, с последующей амплификацией, клонированием и секвенированием было показано, что среди секвенированных клонов наиболее представлены фрагменты последовательности сателлита 3.
Показанная ранее транскрипционная активность в районе 9q12 и экспрессия сателлитной РНК 3 указывает на то, что процесс апоптоза приводит к обогащению внДНК декомпактизованными районами хромосом. Данные о том, что районы декомпактизованного хроматина перепредставлены в составе внДНК крови могут быть использованы для оптимизации поиска ДНК-онкомаркеров, патологически трансформированных клеток, с измененным относительно нормальных клеток профилем плотности упаковки хроматина.
Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Результаты работы были представлены на международной конференции Biology and Biochemistry of Extracellular Nucleic Acids (Новосибирск, Россия, 2003г), V, VI и VII международных конференциях Circulating nucleic acids in plasma and serum (Москва, Россия, 2007; Гонконг, Китай, 2009; Мадрид, Испания, 2011). Результаты диссертации были доложены на международной конференции Физико-химическая биология (Новосибирск, Россия, 2011), на II международной конференции Геномика, протеомика, биоинформатика (Новосибирск, Россия, 2011).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Результатов и их обсуждения, Выводов и Списка цитированной литературы. Работа изложена на 147 страницах, содержит рисунков и 11 таблиц. Библиография включает 283 литературных источника.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Исследование механизмов генерации внеклеточной ДНК Согласно литературным данным деградация геномной ДНК в результате апоптоза является одним из основных источников внеклеточных нуклеиновых кислот (внНК).
Однако в некоторых исследованиях было показано, что эукариотические клетки способны спонтанно секретировать ДНК, и этот процесс не связан с апоптозом (Anker P. et al., 1975). Кроме того, в ряде работ было показано, что ДНК может синтезироваться вне клеток в составе частиц, которые впоследствии получили название УвиртозомыФ (Anker P. et al., 1976; Gahan P.B. et al., 2010). В представленной работе было проведено исследование каждого из возможных механизмов генерации внДНК на примере линий клеток человека.
Для изучения процессов, которые приводят к появлению внДНК, в качестве модельных клеток были использованы клетки эндотелия пупочной вены новорожденных (HUVEC), первичные фибробласты и клетки цервикальной аденокарциномы (HeLa). Эти клетки обладают рядом свойств, предъявляемых к модельным объектам: их культивирование не требует особых условий, они быстро пролиферируют и не склонны к накоплению хромосомных аберраций в ходе культивирования. Следует отметить, что источником первичных эндотелиальных клеток и фибробластов служит доступный биологический материал. Кроме того, использование выбранных клеточных культур позволяет получить данные о механизмах генерации внДНК в нормальных и опухолевых клетках различной тканевой принадлежности.
Помимо внДНК в культуральной среде, нами была исследована внДНК, связанная с плазматической мембраной клеток. Поскольку связывание ДНК с цитоплазматической мембраной опосредовано белками, экспонированными на внешней поверхности плазматической мембраны, для элюции ДНК, связанной с клеточной поверхностью, клетки обрабатывали 0.25% раствором трипсина.
Концентрация трипсина и время обработки клеток были оптимизированы с целью избегания лизиса клеток. Для измерения концентрации внДНК были разработаны методы ПЦР в реальном времени: TaqMan ПЦР на фрагмент последовательности L1 повтора и TaqMan ПЦР на фрагмент гена E7 папиллома вируса HPV-18, который содержится в составе геномной ДНК клеток HeLa. Последовательность L1 повтора была выбрана на основании того, что использование в качестве мишени для ПЦР многокопийных повторов значительно повышает чувствительность определения концентрации ДНК по сравнению с использованием в качестве мишени однокопийных генов. TaqMan ПЦР на фрагмент гена папиллома вируса был использован для селективного определения концентрации ДНК клеток HeLa.
Чувствительность методов TaqMan ПЦР на L1 элементы и фрагмент гена Есоставила 5 и 50 пг геномной ДНК на реакцию, соответственно.
1.1. Исследование синтеза ДНК вне клеток Нами было сделано предположение о том, что на роль автономных частиц (виртозом), способных к саморепликации в культуре клеток человека, и которые с трудом могут быть обнаружены с помощью световой микроскопии, с наибольшей вероятностью подходят клетки микоплазмы. Поэтому для изучения вклада внеклеточного синтеза в процесс появления ДНК во внеклеточной среде, нами были использованы клетки HeLa без микоплазмы, а также клетки HeLa, которые согласно видоспецифичному ПЦР анализу инфицированы микоплазмами M. hyorhinis и M. fermentans.
Клетки HeLa, содержащие и не содержащие микоплазму, культивировали в присутствии биотинилированного производного dUTP. Внеклеточную ДНК из культуральной среды и элюатов с поверхности клеток анализировали в агарозном геле с последующим саузерн-блотом. Биотинилированную ДНК визуализировали при помощи конъюгата авидина с щелочной фосфатазой (Рис. 1).
Рис. 1. Исследование включения биотинилированного производного dUTP клетками линий HeLa, содержащих и не содержащих микоплазму. ВнДНК анализировали в 1.5% агарозном геле с бромистым этидием (А), с последующим Саузерн-блотом и визуализацией биотинилированной ДНК при помощи конъюгата авидина с щелочной фосфатазой (Б). Дорожки 1,6 - внНК из культуральной среды;
2,7 - внНК из ФБ-ЭДТА элюата; 3,8 - внНК из трипсинового элюата; 4,9 - НК из мембранно-цитозольной фракции клеток, 5,10 - НК из ядерной фракции клеток;
11 - маркер молекулярного веса ДНК.
Было показано, что ДНК, содержащая остатки биотина, локализована главным образом на цитоплазматической мембране и в мембранно-цитозольной фракции клеток линии HeLa, содержащих микоплазму. В клетках, не инфицированных микоплазмой, присутствие биотинилированной ДНК в пуле внДНК не было обнаружено (Рис. 1).
В результате выделения биотинилированной ДНК при помощи авидин-сефарозы, с последующим ПЦР анализом фрагментов генов 16S рРНК микоплазмы и 28S рРНК человека было показано, что биотин-содержащая фракция ДНК содержит только ДНК микоплазмы. Таким образом, на поверхности клеток действительно происходит синтез ДНК, но только в случае клеток содержащих микоплазму.
1.2. Влияние индукции апоптоза или стимуляции секреторной активности клеток на концентрацию внеклеточной ДНК Для того чтобы оценить вклад апоптоза в формирование пула внДНК, в культурах первичных и опухолевых клеток апоптоз был индуцирован двумя способами: при помощи обработки клеток этопозидом или культивированием клеток в среде без эмбриональной сыворотки. Как известно, этопозид ингибирует лигазную активность топоизомеразы II, тем самым приводит к накоплению двуцепочечных разрывов в составе ДНК и индукции p53-зависимого апоптоза. При культивировании клеток в среде без эмбриональной сыворотки клетки не получают ростовых факторов, что приводит к индукции апоптоза в результате ингибирования экспрессии ингибитора апоптоза Bcl-2.
Было показано, что обработка клеток этопозидом в течение 24 часов приводит к значительному увеличению концентрации внДНК в культуральной среде и трипсиновом элюате (Рис. 2). Эффективность индукции апоптоза подтверждали окрашиванием клеток кальцеином и пропидий иодидом с последующей флуоресцентной микроскопией (данные не представлены).
Рис. 2. Влияние обработки эндотелиоцитов, фибробластов и клеток HeLa этопозидом на концентрацию внДНК. Клетки культивировали в течение 24 часов в присутствии 30 мкМ этопозида с последующим измерением концентрации ДНК в культуральной среде (А) и трипсиновом элюате (Б) при помощи TaqMan ПЦР на L1 элементы.
В то же время ингибирование апоптоза с помощью обработки клеток ингибитором каспаз Z-VAD-FMK приводит примерно к 50% уменьшению концентрации ДНК в культуральной среде через 24 часа инкубации для всех клеточных линий (Рис. 3).
Изменение концентрации внДНК через 24 часа после индукции или ингибирования апоптоза в целом совпадает с ранее полученными данными о действии этопозида или Z-VAD-FMK на клетки.
Рис. 3. Влияние ингибитора апоптоза Z-VAD-FMK на концентрацию ДНК в культуральной среде первичных клеток и клеток линии HeLa. Клетки культивировали в течение 24 часов в присутствии 50 мкМ Z-VAD-FMK. Концентрацию ДНК в культуральной среде измеряли при помощи TaqMan ПЦР на L1 элементы.
В результате индукции апоптоза в культуре первичных эндотелиоцитов с помощью сывороточного голодания в течение 24 часов наблюдается значительное увеличение концентрации внДНК (Рис. 4).
Рис. 4. Влияние сывороточного голодания на концентрацию внДНК в культуре первичных эндотелиоцитов, фибробластов и клеток HeLa. Клетки культивировали в течение 24 часов в среде без эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) с последующим измерением концентрации ДНК в культуральной среде (А) и трипсиновом элюате (Б) при помощи TaqMan ПЦР на L1 элементы.
Напротив, культивирование первичных фибробластов в среде без сыворотки приводит к практически полному исчезновению ДНК из культуральной среды и одновременному трехкратному увеличению концентрации ДНК, связанной с поверхностью клеток. Культивирование клеток HeLa в среде без сыворотки приводит к пятикратному уменьшению концентрации ДНК в культуральной среде и двукратному увеличению концентрации ДНК, связанной с поверхностью клеток по сравнению с клетками, культивируемыми без предварительного сывороточного голодания (Рис. 4).
В то же время добавление к фибробластам 10% сыворотки после 16 часов сывороточного голодания приводит к более чем десятикратному увеличению концентрации ДНК в культуральной среде и одновременному трехкратному уменьшению концентрации ДНК, связанной с поверхностью клеток, по сравнению с клетками, культивируемыми без предварительного сывороточного голодания (Рис. 5).
В результате окрашивания клеток пропидий иодидом с последующей флуоресцентной микроскопией было показано, что изменение концентрации внДНК под действием сыворотки не связано с индукцией апоптоза (данные не представлены).
Рис. 5. Влияние стимуляции первичных фибробластов сывороткой после сывороточного голодания на концентрацию внДНК. К клеткам, предварительно культивированным в среде без сыворотки, добавляли среду с 10% ЭТС и культивировали течение 4, 8 и 24 часов с последующим измерением концентрации ДНК в культуральной среде и трипсиновом элюате при помощи TaqMan ПЦР на L1 элементы.
Повышение концентрации ДНК в культуральной среде фибробластов при стимуляции сывороткой может быть вызвано стимуляцией клеточной пролиферации, индукцией репликации и секрецией новосинтезированной ДНК во внеклеточную среду. Секреция новосинтезированной ДНК ранее уже наблюдалась при исследовании стимуляции лимфоцитов митогенами. Авторами было показано, что стимулированные лимфоциты после импульсного мечения [3Н]-тимидином секретируют в среду большую часть радиоактивной метки в составе ДНК. С другой стороны, после добавления сыворотки к предварительно голодавшим фибробластам наблюдается перераспределение уже имеющейся внДНК между культуральной средой и трипсиновым элюатом. Действительно, после удаления сыворотки концентрация внДНК в культуральной среде уменьшается, а на поверхности клеток возрастает, в то время как после стимуляции фибробластов сывороткой наоборот концентрация внДНК, связанной с поверхностью клеток уменьшается, а концентрация внДНК в культуральной среде увеличивается (Рис. 5).
Для того чтобы проверить приводит ли добавление сыворотки к клеткам, предварительно культивируемым в среде без сыворотки, к синтезу и секреции вновь синтезированной ДНК, клетки культивировали в присутствии [3Н]-тимидина по схеме, представленной на рисунке 6. Результаты по определению удельной радиоактивности полученных образцов ДНК представлены в таблице 1.
Рис. 6. Схема эксперимента по исследованию секреции новосинтезированной ДНК первичными фибробластами человека. Первичные фибробласты культивировали в присутствии [3Н]-тимидина как показано на схеме. Концентрацию ДНК, выделенной из культуральной среды и ядер клеток, определяли при помощи TaqMan ПЦР на L1 элементы, радиоактивность образцов ДНК определяли методом жидкостносцинтилляционной радиометрии.
Таблица 1. Удельная радиоактивность образцов ДНК, полученных в результате мечения клеток [3Н]-тимидином.
Номер образца Удельная радиоактивность, ДНК1 cpm/нг 1 19.2 3 17.4 16.5 НД6 НД 7 НД 8 10. - порядковый номер указан на схеме (Рис. 5), 2 - ниже уровня детекции.
Было показано, что культивирование клеток в присутствии [3Н]-тимидина приводит к включению [3Н]-тимидина в геномную ДНК клеток. Однако внДНК из культуральной среды клеток, предварительно культивированных в среде без сыворотки и затем стимулированных сывороткой, не содержит радиоактивной метки вне зависимости от времени культивирования клеток и, следовательно, не является вновь синтезированной.
Для исследования влияния сыворотки на перераспределение внДНК между культуральной средой и трипсиновым элюатом фибробласты культивировали в среде без сыворотки в течение 16 часов в присутствии экзогенной нативной внДНК, полученной из культуральной среды клеток HeLa. Затем клетки отмывали средой без сыворотки и добавляли свежую среду с 10% ЭТС. Через 4, 8 и 24 часа ДНК выделяли из культуральной среды и трипсинового элюата. Концентрацию экзогенной внДНК клеток HeLa определяли с помощью TaqMan ПЦР на фрагмент гена E7 папиллома вируса HPV-18, который содержится в составе геномной ДНК клеток HeLa.
Результаты эксперимента представлены на рисунке 7.
Рис. 7. Влияние стимуляции первичных фибробластов эмбриональной сывороткой после сывороточного голодания на концентрацию экзогенной внДНК. Первичные фибробласты инкубировали 16 часов в среде без сыворотки в присутствии нативных комплексов внДНК клеток HeLa. Затем к клеткам добавляли среду с 10% ЭТС и культивировали течение 4, 8 и 24 часов с последующим измерением концентрации ДНК в культуральной среде и трипсиновом элюате при помощи TaqMan ПЦР на фрагмент гена E7 HPV18.
Из полученных данных следует, что после добавления к клеткам сыворотки уже через 4 часа происходит диссоциация половины связанной с поверхностью клеток экзогенной внДНК в культуральную среду (Рис. 7). Следует отметить, что в течение первых 8 часов инкубации общее количество ДНК в культуральной среде и на поверхности клеток практически совпадает с исходным количеством ДНК, связанной с поверхностью клеток, до стимуляции клеток сывороткой. После 24 часов культивирования клеток половина экзогенной ДНК в культуральной среде деградирует.
Таким образом, при стимуляции фибробластов сывороткой после сывороточного голодания происходит диссоциация связанной с поверхностью ДНК в культуральную среду. Эта ДНК не синтезируется de novo, как полагали ранее.
1.3. Влияние ингибиторов секреции на концентрацию внеклеточной ДНК в культурах первичных фибробластов, эндотелиоцитов и клеток HeLa Для изучения вклада активного транспорта клеток в процесс появления внДНК исследуемые линии клеток культивировали в присутствии ингибиторов классического (Гольджи-зависимого) и неклассического (Гольджи-независимого) путей секреции белков (Табл. 2). Эффективность Гольджи-зависимого транспорта оценивали по интенсивности секреции интерлейкина 6, который является индикатором неспецифического иммунного ответа и секретируется клетками по Гольджи-зависимому механизму.
Таблица 2. Ингибиторы транспорта и механизмы их действия.
Ингибитор Механизм действия Монензин Ингибирование функций аппарата Гольджи Глибурид Ингибирование мембранных транспортеров семейства ABC Метиламин Ингибирование эндо-/экзоцитоза путем повышения рН эндо-/экзоциклических везикул Оуабаин Ингибирование Na+/K+-ATФ-азы Цитохалазин Б Ингибирование полимеризации актиновых микрофиламентов Хлорокин Повышает рН эндосом, везикул аппарата Гольджи и лизосом Для оценки влияния ингибиторов секреции на концентрацию внДНК, первичные фибробласты, первичные эндотелиоциты и клетки HeLa инкубировали в присутствии одного из указанных в таблице ингибиторов и, затем, определяли концентрацию ДНК в культуральной среде (Рис. 8).
Было показано, что культивирование клеток, растущих в нормальных условиях, а также фибробластов, стимулированных сывороткой после сывороточного голодания, в присутствии ингибиторов активной секреции белков не приводит к снижению концентрации внДНК в культуральной среде (Рис. 8). При этом обработка фибробластов ингибиторами Гольджи-зависимой секреции приводит к 90% ингибированию секреции клетками ИЛ-6. Полученные данные указывают на то, что классические и неклассические секреторные механизмы клеток не принимают участие в процессах, связанных с генерацией внДНК.
Рис. 8. Влияние ингибиторов клеточного транспорта на концентрацию внДНК.
Эндотелиоциты, фибробласты и клетки HeLa инкубировали в течение 4 часов с одним из ингибиторов:
монензином (10 мкМ), глибуридом (50 мкМ), метиламином (10 мМ), оуабаином (100 мкM), цитохалазином (100 мкM) и хлорокином (100 мкM).
Концентрацию ДНК в культуральной среде измеряли при помощи TaqMan ПЦР на L1 элементы.
Суммируя полученные данные можно сделать вывод о том, что основным источником внДНК в культуре клеток, растущих в нормальных условиях, является апоптоз. Действительно, ингибирование классических и неклассических секреторных механизмов клеток не приводит к достоверному уменьшению концентрации внДНК.
На примере экзогенной внДНК, связанной с клеточной поверхностью, было показано, что стимуляция клеток сывороткой после сывороточного голодания может приводить к диссоциации связанной с поверхностью ДНК в культуральную среду. Однако эта ДНК не синтезируется de novo и не секретируется, как полагали ранее, а имеет апоптотическое происхождение и появляется в результате перераспределения свободной и связанной с поверхностью клеток внДНК. Исследование возможности внеклеточного синтеза ДНК показало, что таковой имеет место, но только в случаях, когда клетки инфицированы микоплазмой. В клетках, свободных от микоплазмы внеклеточного синтеза ДНК не было обнаружено.
2. Исследование представленности различных последовательностей геномной ДНК в составе внеклеточной ДНК Состав последовательностей внДНК был исследован при помощи метода флуоресцентной гибридизации in situ. Этот метод позволяет сравнивать представленность различных последовательностей ДНК в составе нескольких образцов на одном цитологическом препарате, что, в свою очередь, позволяет напрямую выявлять изменения в представленности хромосомных районов.
Необходимым условием для получения этим методом корректных данных является получение из исследуемых образцов ДНК-зондов, с максимально пропорциональной представленностью последовательностей исходной ДНК. Поскольку выбор метода приготовления ДНК-зондов определяется фрагментацией исходной ДНК образца, на первом этапе необходимо было определить размер внДНК в культурах анализируемых линий клеток.
В результате исследования размера фрагментов внДНК при помощи электрофореза в 1.5% агарозном геле после 24 часов культивирования клеток было показано, что во всех клеточных культурах ДНК, выделенная из культуральной среды, представлена фрагментами длинной от 180 до 3500 пар оснований. ДНК из трипсинового элюата представлена в основном высокомолекулярной фракцией с размером фрагментов около 20000 пар оснований (Рис. 9).
Рис. 9. Электрофоретический анализ внДНК, выделенной из культуральной среды (дорожка 2), и трипсинового элюата (дорожка 3) клеток HeLa в 1.5% агарозном геле с бромистым этидием. Внеклеточная ДНК была обработана РНК-азой А (20 мкг/мл, 37С, 30 мин). Дорожки 1, 4 - маркеры молекулярного веса ДНК, дорожка 5 - геномная ДНК.
2.1. Получение ДНК-зондов при помощи метода LA-ПЦР Основываясь на полученных данных о длине фрагментов внДНК, были выбраны две стратегии изготовления ДНК-зондов.
ДНК, связанная с поверхностью клеток, представлена высокомолекулярными фрагментами, и её сравнение корректно проводить непосредственно с геномной ДНК. Для выявления перепредставленных последовательностей в составе ДНК из культуральной среды нами была использована ДНК, выделенная из культуральной среды апоптотических клеток, которая совпадает по длине фрагментов с ДНК из культуральной среды интактных клеток. Схема получения ДНК зондов при помощи LA-ПЦР представлена на рисунке 10.
Рис. 10. Общая схема получения ДНК-зондов из ДНК, связанной с поверхностью клеток, геномной ДНК, ДНК из культуральной среды нормальных и апоптотических клеток при помощи метода LA-ПЦР.
ДНК-зонды из геномной и внДНК анализируемых клеточных линий были получены в оптимизированных условиях согласно представленным выше схемам.
Продукты LA-ПЦР были проанализированы при помощи электрофореза в 1% агарозном геле. Было показано, что в ходе LA-ПЦР клеточной и внДНК наблюдается амплификация фрагментов ДНК размером от 200 до 1200 п.н. (Рис. 11).
Рис. 11. Электрофоретический анализ ДНК-зондов, полученных из геномной ДНК и ДНК, связанной с поверхностью клеток (А), а также ДНК-зондов, полученных из ДНК, выделенной из культуральной среды, и апоптотической ДНК (Б), в 1% агарозном геле. М - маркеры длины ДНК; E - первичные эндотелиоциты, F - первичные фибробласты, H - HeLa.
2.2. Цитогенетический анализ ДНК-зондов, полученных из геномной, апоптотической и внеклеточной ДНК ДНК-зонды, полученные из внДНК, были мечены в результате ПЦР дигоксигенином, а ДНК-зонды, полученные из геномной и апоптотической ДНК - биотином. Совместную гибридизацию ДНК-зондов, полученных из геномной и внеклеточной ДНК, проводили с одним препаратом метафазных хромосом человека.
ДНК-зонды детектировали при помощи антител к дигоксигенину, меченых флуоресцентным красителем Cy-3, и стрептавидином, меченым флуоресцеином.
В результате анализа ДНК-зондов, полученных из ДНК, связанной с поверхностью клеток, и геномной ДНК первичных фибробластов, а также клеток HeLa были выявлены отличия в представленности ДНК хромосом 1, 5, 9 и 19. При анализе ДНК-зондов, полученных из ДНК, связанной с поверхностью клеток, и геномной ДНК первичных эндотелиоцитов, отличие в представленности наблюдается только в хромосоме 9 (Рис. 12).
Для детального анализа выявленных районов хромосом были построены профили относительной интенсивности флуоресцентных сигналов (Рис. 13).
Рис. 12. Двухцветная FISH ДНК-зондов, полученных из геномной ДНК, меченых биотином (зеленый канал) и ДНК, связанной с поверхностью клеток, меченых дигоксигенином (красный канал) на метафазных хромосомах лейкоцитов человека.
Полученные данные демонстрируют, что в составе ДНК, связанной с поверхностью первичных фибробластов, по сравнению с геномной ДНК, перепредставлены фрагменты прицентромерного района хромосомы 9. В составе ДНК, связанной с поверхностью клеток HeLa, перепредставлены прицентромерные районы 1, 5 и 9 хромосомы. При анализе ДНК-зондов, полученных из ДНК, связанной с поверхностью клеток, и геномной ДНК первичных эндотелиоцитов, отличие наблюдается только в хромосоме 9. В остальных хромосомах профили относительной интенсивности флуоресцентных сигналов внеклеточной и геномной ДНК совпадают.
Рис. 13. Анализ профилей относительной интенсивности флуоресцентных сигналов хромосом после проведения двухцветной FISH ДНК-зондов, полученных из геномной ДНК (зеленый канал) и ДНК, связанной с поверхностью клеток, (красный канал). Синий канал - флуоресцентный сигнал DAPI.
Аналогичным способом были исследованы отличия в представленности между ДНК-зондами, полученными из внДНК, выделенной из культуральной среды нормальных и апоптотических клеток.
В результате сравнения ДНК-зондов, полученных из внеклеточной и апоптотической ДНК первичных фибробластов, были выявлены отличия в интенсивности флуоресценции отдельных районов 1 и 9 хромосом, а также акроцентрических хромосом (13, 14, 15, 21, 22). При анализе ДНК-зондов, полученных из внДНК и апоптотической ДНК первичных эндотелиоцитов и клеток HeLa, отличий не было выявлено (Рис. 14).
Рис. 14. Двухцветная FISH ДНК-зондов, полученных из апоптотической ДНК, меченых биотином (зеленый канал) и ДНК, выделенной из культуральной среды, меченых дигоксигенином (красный канал) на метафазных хромосомах лейкоцитов.
Для детального анализа выявленных районов хромосом были построены профили относительной интенсивности флуоресцентных сигналов (Рис. 15).
Полученные данные демонстрируют, что в составе внДНК первичных фибробластов перепредставлены фрагменты ДНК из прицентромерного района хромосомы 9 и дистальных плечей акроцентрических хромосом 13, 14, 15, 21, 22 по сравнению с апоптотической ДНК. Для клеток HUVEC и HeLa профили относительной интенсивности флуоресцентных сигналов апоптотической и внДНК совпадают.
Однако следует отметить, что в составе ДНК-зондов, полученных из апоптотической и внДНК клеток HeLa, перепредставлены последовательности дистальных плечей акроцентрических хромосом 9, 14, 15 и 22.
Из полученных данных следует, что для всех клеточных культур в составе ДНК, связанной с клеточной поверхностью, перепредставлен прицентромерный района хромосомы 9. В случае клеток линии HeLa кроме прицентромерного района хромосомы 9 наблюдается перепредставленность прицентромерных районов хромосом 1 и 5. Состав последовательностей ДНК, выделенной из культуральной среды нормально растущих и апоптотических клеток, не отличается для клеток HUVEC и HeLa. Однако в случае первичных фибробластов была обнаружена перепредставленность прицентромерного района хромосомы 9 и дистальных плечей акроцентрических хромосом. Учитывая тот факт, что в культуре клеток, растущих при нормальных условиях, основным источником внДНК является апоптоз можно сделать вывод о том, что по представленности последовательностей апоптотическая ДНК отличается от геномной.
Рис. 15. Анализ профилей относительной интенсивности флуоресцентных сигналов хромосом после проведения двухцветной FISH ДНК-зондов, полученных из ДНК культуральной среды апоптотических клеток (зеленый канал) и ДНК из культуральной среды интактных клеток (красный канал). Синий канал - флуоресцентный сигнал DAPI.
3. Микродиссекция и секвенирование ДНК-зондов, гибридизующихся в районе 9qДля детального исследования перепредставленных внДНК, гибридизующихся в районе 9q12 была выполнена микродиссекция этого района после гибридизации флуоресцентно меченых ДНК-зондов. Для этого из внДНК были получены ДНК-зонды, меченые флуоресцентным красителем TAMRA, которые гибридизовали с метафазными хромосомами человека, и, затем, проводили микродиссекцию района 9q12 под флуоресцентным микроскопом. Полученные при помощи микродиссекции образцы ДНК амплифицировали при помощи ПЦР с использованием праймера, комплементарного 5Т и 3Т-концам ДНК-зондов (Рис. 16).
Рис. 16. Схема экперимента для определения перепредставленных последовательностей внеклеточной ДНК.
Полученные продукты ПЦР были клонированы в плазмиде pBluescript SK II(-), 100 клонов, содержащих вставку, было секвенировано по методу Сэнгера. Анализ секвенированных последовательностей был проведен с помощью базы данных BLAST сервера ( и базы данных повторяющихся последовательностей генома RepeatMasker (
В результате определения удельного содержания различных классов и подклассов повторяющихся элементов генома в составе секвенированных последовательностей из диссектированного района 9q12 было обнаружено, что во внДНК наиболее представлены повторы сателлитной ДНК (22%). В результате выравнивания последовательностей, соответствующих сателлитной ДНК, с помощью программного обеспечения Vector NTI, было обнаружено, что 20% секвенированных последовательностей содержат фрагменты консенсуса сателлита 3 (HSAT III), который состоит из прямых и инвертированных повторов пентаолигонуклеотида GGAAT, разделенных декаолигонуклеотидом CAAC(C/A)CGAGT.
Из литературных данных известно, что последовательности HSAT III на метафазных препаратах хромосом выявляются в прицентромерных районах большинства хромосом, за исключением хромосом 2, 6, 8, 11, 12, 18, 19 и X. Район 9q12 содержит основную часть HSAT III повторов, по сравнению с другими хромосомами. Минорные сайты гибридизации ДНК-зондов, содержащих последовательности HSAT III, находятся в прицентромерных районах хромосом 1, 5, 10, 17, 20 и акроцентрических хромосом. То есть отличие в представленности между внеклеточной и геномной ДНК в прицентромерных районах 1, 5 и акроцентрических хромосом может дополнительно свидетельствовать о перепредставленности HSAT III повторов в составе внДНК.
Последовательности HSAT III, которые по нашим данным перепредставлены в составе внДНК, расположены в прицентромерных районах большинства хромосом и формируют конститутивный гетерохроматин. Как известно одним из критериев гетерохроматина является нетранскрибируемость этих участков сопровождающаяся гиперметилированием ДНК. Однако в некоторых случаях ДНК конститутивного гетерохроматина может транскрибироваться. Например, последовательности HSAT III транскрибируются в клетках, находящихся в условиях стресса, например, теплового шока или индукции апоптоза. Кроме того, было показано, что при старении клеток также происходит деметилирование HSAT III, что приводит к разрыхлению упаковки хроматина, и повышает доступность района 9q12 для нуклеазного гидролиза. Следовательно, перепредставленность в составе внДНК последовательностей района 9q12 вероятно отражает влияние плотности упаковки исходной геномной ДНК на представленность определенных участков генома в составе внДНК. Установленная ранее связь между транскрипционной активностью и плотностью упаковки хроматина в районе 9q12 указывает на то, что генерация внДНК в результате апоптоза приводит к обогащению внДНК декомпактизованными районами хромосом.
ВЫВОДЫ 1. Исследовано участие активной секреции ДНК, секреции de novo синтезированной ДНК, синтеза ДНК вне клеток и апоптоза в процессе генерации внеклеточных ДНК в культурах клеток линии HeLa, первичных эндотелиоцитов и фибробластов человека. Показано, что Гольджи-зависимые и Гольджи-независимые пути секреции не вовлечены в процесс генерации внеклеточной ДНК.
De novo синтезированная ДНК также не секретируется клетками. Показано, что эукариотическая ДНК не синтезируется во внеклеточном пространстве первичных и трансформированных клеток. Внеклеточный синтез ДНК обнаружен только в культурах клеток, инфицированных микоплазмой. При помощи индукции/ингибирования апоптоза показано, что основным источником внеклеточной ДНК в культуре клеток является апоптоз.
2. Исследован состав последовательностей внеклеточной ДНК в исследуемых культурах клеток с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ. На основании анализа длин фрагментов внеклеточной, апоптотической и геномной ДНК выбран и оптимизирован метод LA-ПЦР, который позволяет получить ДНК зонды максимально идентичные исходным образцам ДНК. В результате проведения двухцветной флуоресцентной гибридизации in situ с последующим анализом профилей относительной интенсивности флуоресцентного сигнала хромосом показано, что внеклеточная ДНК отличается по составу последовательностей от геномной ДНК. Отличия в представленности были обнаружены в составе прицентромерного района хромосомы 9, а также дистальных плечей акроцентрических хромосом.
3. В результате микродиссекции флуоресцентно меченых зондов, гибридизующихся в районе 9q12, с последующей амплификацией, клонированием и секвенированием было показано, что в составе внеклеточной ДНК перепредставлены фрагменты последовательности сателлита 3.
Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:
1. Morozkin E.S., Laktionov P.P., Rykova E.Y., Vlassov V.V. Fluorometric quantification of RNA and DNA in solutions containing both nucleic acids // Anal. Biochem. Ц2003. ЦV. 322. ЦP. 48-50.
2. Morozkin E.S., Laktionov P.P., Rykova E.Y., Bryzgunova O.E., Vlassov V.V.
Release of nucleic acids by eukaryotic cells in tissue culture // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. Ц2004. ЦV.23. ЦP. 929-933.
3. Morozkin E.S., Laktionov P.P., Rykova E.Y., Vlassov V.V. Extracellular nucleic acids in cultures of long-term cultivated eukaryotic cells // Ann. N. Y. Acad.
Sci. Ц2004. ЦV. 1022. ЦP. 244-249.
4. Morozkin E.S., Babochkina T.I., Vlassov V.V., Laktionov P.P. The effect of protein transport inhibitors on the production of extracellular DNA // Ann. N. Y.
Acad. Sci. Ц2008. ЦV. 1137. ЦP. 31-35.
5. Морозкин Е.С., Сильников В.Н., Рыкова Е.Ю., Власов В.В., Лактионов П.П.
Внеклеточная ДНК в культуре первичных и трансформированных клеток, инфицированных и не инфицированных микоплазмой // Бюл. эксперим.
биологии и медицины. Ц2009. ЦТ. 147. ЦС. 67-71.
6. Морозкин Е.С., Лосева Е.М., Задесенец К.С., Рубцов Н.Б., Власов В.В., Лактионов П.П. Исследование состава внеклеточной ДНК в культуре клеток человека с помощью FISH // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. Ц2010. ЦТ. 8. ЦС. 3-10.
7. Morozkin E.S., Loseva E.M., Mileyko V.A., Zadesenets K.S., Rubtsov N.B., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Comparative study of extracellular DNA by FISH // Circulating nucleic acids in plasma and serum. Ed. Gahan P.B.
Springer. Ц2011. ЦP. 143-146.