Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
КУЧМИЙ АННА АЛЕКСАНДРОВНА
ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ ЛИНИЙ РЕПОРТЕРНЫХ МЫШЕЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ IN VIVO И IN VITRO
03.01.03 - молекулярная биология
Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2012
Работа выполнена в Лаборатории молекулярной иммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук
Научный консультант: заведующий Лабораторией молекулярной иммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук, доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Недоспасов С.А.
Официальные оппоненты: заведующий Лабораторией иммунохимии Федерального государственного бюджетного учреждения Государственного научного центра Института Иммунологии Федерального медикобиологического агентства России, доктор биологических наук, профессор Филатов А.В.
руководитель Группы эпигенетических механизмов регуляции активности генов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук, доктор биологических наук Тиллиб С.В.
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук
Защита состоится л ____________2012 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д. 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул.Вавилова, д.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ Института Молекулярной Биологии им.
В.А.Энгельгардта Российской академии наук Автореферат разослан л ____________2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук А.М. Крицын
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Фактор Некроза Опухолей (Tumor Necrosis Factor,TNF) - плейотропный провоспалительный и иммунорегуляторный цитокин, играющий важную роль в защите организма от внутриклеточных патогенов и организации структуры вторичных лимфоидных органов. Нарушение регуляции и избыточная продукция TNF приводят к развитию ряда аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит, псориаз, а в острых случаях может приводить к симптомам септического шока. Фармакологическая блокировка TNF оказалась эффективной при лечении некоторых аутоиммунных заболеваний и была одобрена для применения в клинике.
Однако, системная инактивация TNF является симптоматическим лечением и сопряжена с рядом осложнений, таких как повышенная восприимчивость к инфекциям, реактивация туберкулеза и некоторыми другими. Для преодоления побочных эффектов анти-TNF терапии ведется разработка альтернативных подходов к ингибированию действия TNF, в том числе и предложенная нашей лабораторией стратегия блокировки TNF из определенных клеточных источников.
Исследования нашей лаборатории показали, что некоторые биологические функции TNF зависят от вида клеток-продуцентов и их локализации (Grivennikov S, Immunity, 2005;
Tumanov et al. Blood, 2010; Kruglov, JI, 2011). Так, блокирование цитокина, производимого отдельным типом клеток, или в определенных тканях может нейтрализовать преимущественно негативные эффекты TNF, сохраняя его защитные функции. Вместе с тем, роль индивидуальных клеточных источников TNF в патогенезе аутоиммунных заболеваний по-прежнему до конца не понята. Более того, на настоящий момент далеко не все подтипы клеток, экспрессирующих TNF, хорошо охарактеризованы, и не исключено, что существуют новые типы клеток - как иммунных, так и стромальных - продуцирующих TNF в норме и при различных патологиях.
Чтобы подробно охарактеризовать экспрессию TNF на молекулярном уровне, клеточном уровне и на уровне целого организма, нами получены и изучены 2 линии новых репортерных мышей, экспрессирующих два разных флуоресцентых белка. Во-первых, в сотрудничестве с Д. Чудаковым и С. Лукьяновым (Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) получены мыши, в которых транскрипция TNF сопряжена с экспрессией дальнекрасного флуоресцентного белка Katushka (TNF-2A-Kat, сокращенно Kat-TNF). Во-вторых, в сотрудничестве с И. Гореном и А. Вайсманом, (Медицинский факултьтет Университета им.
Йохана Гутенберга в Майнце), были получены трансгенные мышиные модели, в которых синтез TNF сопряжен с экспрессией зеленого флоресцентного белка eGFP (del RP23EGfp3126), сокращенно еGFP-TNF. Эти мыши были предоставлены нам для изучения.
В обоих случаях флуоресцентные белки являются репортерами синтеза TNF. Однако в eGFP-TNF репортерных мышах намеренно был ослаблен контроль экспрессии мРНК зеленого репортерного белка (по сравнению с TNF) и такая система, согласно дизайну, отражает продукцию патогенного TNF в отсутствие супрессорных механизмов (Kontoyiannis D, Immunity, 1999). Такую eGFP-TNF репортерную систему, отражающую продукцию патогенного TNF, было интересно изучить одновременно с репортерной системой Kat-TNF, которая содержит все регуляторные элементы и является физиологически корректной. Для этого линии мышей были скрещены друг с другом (сокращенное название гибридной линии Kat*eGFP-TNF).Оказалось, что репортерные белки eGFP и Katushka в Kat*eGFP-TNF мышах, когда синтезируются в одной клетке, не влияют на экспрессию друг друга (контроль репортерных мышей только с eGFP-TNF трансгеном не приведен в рамках этой работы). Благодаря этому была получена уникальная линия двойных репортерных мышей, которая отражает разные аспекты экспрессии TNF.
В предыдущих вариантах TNF-репортерных мышей использовались другие, менее совершенные, типы меток и методы детекции сигнала. Так, в линии мышей CAT-TNF (Beutler, PNAS, 1992) экспрессия TNF определялась по активности хлорамфениколтрансферазы в гомогенатах тканей. В этом случае невозможно проанализировать экспрессию TNF на уровне отдельных клеток, и неприменимы микроскопические методы анализа. При биолюминесцентной детекции в TNF-Luc модели (Kravchenko, Science, 2008), в свою очередь, достигается меньшее разрешение, нежели чем при флуоресцентных методах анализа. Использование генетически запрограммированной флуоресцентной метки позволяет сортировать популяции живых клеток, помеченных флуорофором, и анализировать фенотип TNF-продуцентов на уровне одной клетки ex vivo. При помощи микроскопических методов in vivo можно локализовать помеченные клетки внутри органа, проследить их динамику и межклеточные взаимодействия в тканях живых экспериментальных животных.
Таким образом, нами были получены и/или охарактеризованы новые животные модели для детального изучения роли TNF, производимого отдельными типами клеток, в норме и при патологиях на молекулярном, клеточном и организменном уровнях. Подобные модели в перспективе применимы и для разработки/тестирования нового поколения ингибиторов TNF.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение и/или характеристика новых линий TNF-репортерных мышей с генетически-запрограммированной флуоресцентной меткой, экспрессируемой совместно с TNF. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Получение и характеристика новой линии репортерных мышей Kat-TNF, где экспрессия TNF сопровождается экспрессией красного флуоресцентного белка Katushka.
Характеристика двойной репортерной линии мышей Kat*eGFP-TNF, в которой есть еще один маркер экспрессии TNF - зеленый флуоресцентный белок eGFP.
2. Анализ соответствия экспрессии флуоресцентных меток TNF-продукции в иммуноцитах репортерных мышей в ответ на TNF-индуцирующий стимул in vitro, а именно, изучение экспрессии флуоресцентных маркеров и TNF в миелоидных клетках после стимуляции липополисахаридом (ЛПС) и в лимфоцитах после стимуляции форбол-12миристил-13-ацетатом (ФМА) совместно с иономицином.
3. Анализ транскрипционной регуляции и экспрессии TNF, закодированного трансгенной вставкой Kat-TNF, и красного флуоресцентного белка, в первичных культурах макрофагов из Kat-TNF линии мышей.
4. Анализ применимости флуоресцентной репортерной системы Kat-TNF для изучения экспрессии TNF in vivo в моделях септического шока, индуцированного ЛПС, аутоиммунного гепатита, индуцированного конканавалином - А (Кон A) и при экспериментальном энцефаломиелите - мышиной модели рассеянного склероза.
5. Анализ экспрессии TNF, красного и зеленого репортерных белков в лимфоидных органах из наивных неиммунизованных Kat*GFP-TNF мышей.
Научная новизна работы. В ходе этой работы была получена и охарактеризована новая уникальная линия генетически модифицированных мышей Kat-TNF, в геном которых методом трансгенеза была интегрирована репортерная конструкция, программирующая параллельную экспрессию TNF и красного флуоресцентного белка Katushka. В состав конструкции для получения линии мышей Kat-TNF включены все известные регуляторные элементы гена TNF, в том числе последовательность самого гена TNF с энхансерным элементом в 3-м интроне и 3Т-нетранслируемой областью, что обеспечивает сохранение правильной регуляции трансгена. Белок Katushka обладает уникальными спектральными характеристиками ex=588нм и em =633нм (Shcherbo, Nat.Methods, 2007), длины волн возбуждения и эмиссии этого белка попадают в лоптическое окно, благоприятное для проникновения флуоресценции сквозь живые ткани (630-1100 нм). Следует отметить, что на момент создания Kat-TNF -репортерной модели была опубликована только одна трансгенная линия мышей, созданная с использованием белка Katushka (Diguez-Hurtado R, Genesis, 2011).
Одновременно и независимо коллегами из Университета им. Йохана Гутенберга в Майнце, была получена другая трансгенная TNF-репортерная линия мышей eGFP-TNF, в которой экспрессия TNF сопряжена с экспрессией зеленого флуоресцентного белка с улучшенными спектральными характеристиками. В случае eGFP-TNF мышей использовалась другая конструкция на основе искусственной бактериальной хромосомы (bacterial artificial chromosome, BAC). Особенностью этой конструкции является то, что экспрессия eGFP регулируется только промоторной областью TNF и в ней отсутствуют важные регуляторные элементы - AU-богатые участки, расположенные в 3Т-нетранслируемой области гена TNF.
В результате скрещивания Kat-TNF и eGFP-TNF была получена еще одна линия двойных репортерных мышей Kat*eGFP-TNF, которая отчасти представляет собой пример комплементации двух трансгенов.
Две созданные модели представляют собой первый пример использования флуоресцентного белка для мечения TNF-экспрессирующих клеток. Использование флуоресцентной метки является перспективным подходом для выявления экспрессии TNF на уровне одной клетки, позволяющим осуществлять всесторонний анализ с использованием современных флуоресцентных методов.
В работе по характеристике Kat-TNF и Kat*eGFP-TNF мышей было показано, что экспрессия флуоресцентных белков соответствует экспрессии TNF. Таким образом, впервые становится возможным с большой точностью и разрешением определять клетки, экспрессирующие TNF в ответ на различные стимулы in vitro и in vivo. Совместно с доктором Ф.Сиффриным из Лаборатории иммунодинамики в центральной нервной системе, Медицинского Университета в Майнце, при помощи Kat-TNF репортерных мышей удалось наблюдать TNF-продуценты в инфильтратах спинного мозга в модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита с использованием двухфотонной микроскопии in vivo в живых экспериментальных животных.
При анализе двойных репортерных мышей была обнаружена выраженная базальная экспрессия eGFP в иммуноцитах из наивных, неиммунизованных мышей, указывающая на корректное функционирование промотора гена TNF в составе eGFP-TNF конструкции, при нарушенной регуляции AU-богатыми участками. Таким образом, Kat*eGFP-TNF мыши представляют собой первый пример флуоресцентной репортерной системы с высокой чувствительностью к транскрипции гена TNF in vivo.
В результате, полученные модели (каждая из которых имеет свои особенности) являются не имеющим аналогов инструментом для изучения регуляции биосинтеза и биологических функции TNF в норме и при патологиях с использованием современных методов флуоресцентного анализа. При помощи этих моделей удалось обнаружить конститутивную экспрессию циоткина Т-клетками в пейеровых бляшках кишечника.
Научно-практическая ценность. Модели TNF-репортерных мышей, охарактеризованные в данной работе, могут быть в дальнейшем использованы для фундаментальных и прикладных исследований в области биологии TNF с применением современных методов флуоресцентного анализа.
В линии Kat-TNF мышей методами проточной цитофлуориметрии с высокой точностью можно определить фенотип TNF-экспрессирующих клеточных субпопуляций in vitro и в условиях модели ЛПС-токсичности in vivo. Более того, линия Kat-TNF репортерных мышей была положительно охарактеризована для in vivo микроскопии нервной системы в условиях модели экспериментального энцефаломиелита. Таким образом, применение Kat-TNF мышей в других моделях TNF-зависимых заболеваний (коллаген-индуцированный артрит, колит, индуцированный CD4+CD45RBhi T-клетками и др.) позволит определить фенотип TNF-экспрессирующих клеток, проследить за их миграцией и межклеточными взаимодействиями in vivo, и установить роль этих клеток в патогенезе заболеваний. Методы проточной цитофлуориметрии так же позволяют выделять высокоочищенные субпопуляции жизнеспособных TNF-экспрессирующих клеток для последующего транскриптомного анализа.
Результатом отсутствия регуляторных AU-богатых элементов в конструкции для получения eGFP-TNF репортерной модели стало то, что клетки, в которых транскрипция TNF в норме незначительна (или даже отсутствует), экспрессируют детектируемые уровни зеленого, репортерного для TNF белка. Такая модель представляет собой интерес для чувствительного поиска новых источников TNF в наивных неиммунизованных мышах - эти клетки могут оказаться важными для развития патологии. С другой стороны, транскрипция гена TNF не означает экспрессию цитокина этими клетками. Характеристика синтеза TNF eGFP+ клетками является фундаментальной задачей для будущих работ.
Апробация работы. Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместном коллоквиуме Лаборатории молекулярной иммунологии и Лаборатории иммунорегуляции при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук. Результаты работы были представлены на 13-ом международном TNF конгрессе, л TNF 2011, Хиого, Япония, 2011.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, которые соответствую требованиям, предъявляемым Высшей аттестационной комиссией.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы ( глав), раздела Материалы и Методы ( глав), результатов и обсуждения ( глав), заключения и выводов. Диссертация изложена на странице машинописного текста, содержит рисунков. Список литературы включает работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ К моменту начала работы сотрудниками лаборатории молекулярной иммунологии Учреждения Российской академии наук ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН с помощью стандартных биоинформатических и молекулярно-генетических методов был проведен дизайн, клонирование и наработка генно-инженерной TNF-репортерной конструкции KatTNF. Цикл работ по инъекциям линейной Kat-TNF конструкции в ооциты осуществлялся в отделении по работе с трансгенными животными Института Клеточной Биологии и Генетики им. Макса Планка, Дрезден, Германия. Отбор животных, имеющих в геноме трансгенную вставку, и контроль количества копий вставки осуществлялся стандартными методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизации по Саузерну.
Первичные культуры клеток были получены с использованием стандартных клеточных методов. Костномозговые макрофаги были дифференцированы из клеток костного мозга in vitro в присутствии макрофагального колониестимулирующего фактора (30нг/мл).
Поляризация подтипов Т-хелперных клеток осуществлялась путем стимуляции наивных CD4+ CD62L+CD25- Т-клеток сочетанием антител к CD3 (1мкг/мл) и CD28 (1мкг/мл) в присутствии специфичных цитокинов, определяющих тип дифференцировки. Для получения Т-хелперных клеток 1-го типа использовались рекомбинантный цитокин IL-12 (5нг/мл) и антитела, блокирующие IL-4 (10мкг/мл). Для получения Т-хелперных клеток 2 типа дополнительно использовали рекомбинантный цитокин IL-4 (10нг/мл) и нейтрализующие антитела к цитокину IL-12 (10мкг/мл) и к цитокину IFN (10мкг/мл). Блокирующие антитела к упомянутым цитокинам добавлялись для увеличения эффективности поляризации Тхелперных клеток. Фенотип клеток, экспрессирующих TNF, красный флуоресцентный белок и зеленый флуоресцентный белок после стимуляции in vitro определялся методами иммунофлуоресцентного окрашивания и последующего анализа на проточном цитофлуориметре BD LSRFortessa. Для детекции красного флуоресцентного белка использовалась следующая конфигурация прибора: фильтр нижних частот 600 нм, полосовой фильтр 610/20нм, при ex= 561 нм (желто-зеленый лазер, 100 мВ). Для визуализации флуоресцентной метки в клетках и на гистологии тканей использовались стандартные методы конфокальной микроскопии на приборе Zeiss LSM 710 при ex=591нм и ex=488 нм.
Оценка транскрипционной регуляции красного репортерного белка и гена TNF осуществлялась при помощи ПЦР в реальном времени продуктов обратной транскрипции.
Применимость флуоресцентной репортерной системы Kat-TNF для изучения TNF in vivo анализировалась в моделях септичекого шока, индуцированного элементом клеточной стенки Грам+ бактерий - липополисахаридом (ЛПС, 50 мкг/мышь), и Конканавалин А (КонА, 20мг/кг) - индуцированного аутоиммунного гепатита при помощи вышеприведенных иммунофлуоресцентных методов. Для исследования токсичности TNF, транскрибируемого с трансгенной вставки, использовался тест восстановления MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)2,5-дифенилтетразолиум бромид, желтый тетразоль) до диформазана живыми клетками линии WEHI 164 клон 13.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение и отбор линии трансгенных TNF-репортерных мышей.
Для получения линии TNF-репортерных мышей Kat-TNF применяли методику трансгенеза с использованием для микроинъекций генетической конструкции, изображенной на Рис. 1A.
Для того, чтобы максимально сохранить регуляторные генетические элементы, ответственные за правильный биосинтез TNF, в генетической конструкции использовалась часть локуса TNF/LT размером в 11 т.п.н., в частности, была включена последовательность самого гена TNF с энхансерным элементом в 3-м интроне и 3Т-нетранслируемой областью. В качестве флуоресцентной метки для TNF-экспрессирующих клеток использовался белок Katushka.
Для раздельного синтеза TNF и красного флуоресцентного белка с единого транскрипта Kat-TNF использовалась генетическая последовательность вирусного 2А пептида, работающая по механизму рибосомального пропуска: в результате стерических взаимодействий в пептидильном центре при трансляции 2А пептида рибосома делает пропуск между 19-тым остатком глицина на С-конце и 20-ым остатком пролина на N-конце.
В результате с общей мРНК сначала экспрессируется TNF с дополнительными аминокислотами на С-конце, а затем экспрессируется белок Katushka.
Для получения eGFP-TNF репортерных линий мышей использовался подход трансгенеза, где в качестве генетической конструкции была использована модифицированная искусственная бактериальная хромосома BAC (схема конструкции изображена на рис.1Б).
BAC представляет собой F-плазмиду фертильности бактерий, в которую клонированы фрагменты генома мыши. Общие размеры такого конструкта составляют порядка 150- 350 т.п.н. В данном случае, в BAC с локусом TNF/LT вместо гена TNF путем сайтспецифической рекомбинации были встроены последовательность зеленого флуоресцентного белка и последовательность гена устойчивости к неомицину (NEOкассета), фланкированная FRT сайтами для узнавания Flp-рекомбиназой. NEO-кассета выступает в качестве маркера положительной селекции для отбора BAC-плазмиды, в которой прошла рекомбинация. Получившаяся BAC-конструкция использовалась для микроинъекций. После получения трансгенной линии eGFP-TNF, несущей NEO-кассету, маркер положительной селекции был удален из генома в результате сайт-специфической Flp-опосредованнной рекомбинации во всем организме. Делеция во всем организме достигалась путем скрещивания eGFP-TNF мышей, несущих NEO-кассету, с мышами, у которых Flp-рекомбиназа экспрессирутеся убиквитарно. В результате, в репортерной конструкции eGFP-TNF экспрессия зеленого репортерного белка находится под контролем промотора TNF и 3Т-энхансера NFB (B4, B4а, B4аb), при этом синтез eGFP не регулируется AU- богатыми участками в 3Т-нетранслируемой области.
А.
mLT mLT Kat-TNF UTR Kat UTR 200п.о.
mLT eGFP-TNF mLT Б.
UTR eGFP NEO 150п.о.
Рис. 1 Получение линий трансгенных TNF-репортерных мышей. А. Схема генетической конструкции для получения линии TNF-2А-Кат, в дальнейшем Kat-TNF.Обозначения: mLT - ген лимфотоксина мыши, mLT - ген лимфотоксина мыши, UTR - нетранслируемая 3Т последовательность, Kat-TNFЦ последовательность, содержащая ген TNF (боковая штриховка), и ген флуоресцентного белка Katushka - Kat (сетка), разделенные последовательностью вирусного 2А пептида (черная заливка). Б. Схема генетической конструкции для получения del RP23EGfp3126 или eGFP-TNF репортерной линии мышей. Обозначения: схематически указана последовательность дополнительных генов, еGFP - усиленный зеленый флуоресцентный белок(волна) с pA-сигналом полиаденилирования (белая заливка), NEO - кассета устойчивости к неомицину (серая заливка), фланкированная FRT-сайтами (прямоугольники с кружочками).
В результате микроинъекций конструкции Kat-TNF были получены 6 линий животных, несущих различное число копий трансгена Кат-TNF (данные приведены в полном тексте диссертации). Анализ экспрессии TNF и красного флуоресцентного белка в мононуклеарных клетках периферической крови после стимуляции ЛПС (10мкг/мл) позволил отобрать линию номер 6, показавшую наиболее высокий уровень экспрессии репортёрного белка с корреляцией между экспрессией TNF и Katushka. Таким образом, линия мышей Kat-TNF-6 с двумя копиями трансгенной вставки была использована в дальнейшей работе. Линия eGFPTNF-репортерных животных была отобрана и первично охарактеризована в лаборатории А.
Вайсмана (Майнц). Путем скрещивания Kat-TNF и eGFP-TNF трансгенных линий была получена линия двойных репортерных мышей (Kat*eGFP-TNF), непосредственно охарактеризованная в нашей работе.
2. Характеристика экспрессии репортерных белков и TNF в миелоидных клетках линий репортерных мышей in vitro.
TNF, продуцирующийся миелоидными клетками, играет критическую роль при инициации и развитии реакции воспаления в ответ на активацию Toll - подобных рецепторов (TLR) различными патогенами. Активация клеток врожденного иммунитета эндотоксином через TLR4 является хорошо охарактеризованной моделью экспрессии молекул воспалительного ответа, в том числе и TNF (Shakhov AN, J.Exp.Med., 1990; Hargreaves DC, Cell, 2009). Для того, чтобы проанализировать, насколько экспрессия флуоресцентных белков отражает синтез TNF в миелодных клетках, была использована система in vitro, в которой свежевыделенные клетки из вторичных лимфоидных органов были стимулированы ЛПС (100нг/мл) в присутствии брефельдина А (5мкг/мл) для внутриклеточного накопления TNF. В ответ на ЛПС нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки из мышей дикого типа производят TNF, как это показано на рис.2А, Б. В случае Kat-TNF репортерных мышей наблюдается высокая корреляция экспрессии TNF и красного репортерного белка (Рис. 2Б, черная стрелка). Таким образом, TNF-экспрессирующие CD11b+CD11c- макрофаги, CD11b+CD11c+ дендритные клетки и CD11bhigh CD11c- нейтрофилы оказываются помечены белком Katushka. Примечательно, что в нестимулированных ЛПС клетках Katushka не детектировалась.
все клетки все клетки А. Б. В.
дикий тип Kat-TNF Kat*GFP-TNF 0.3.6 2.0 0.2,0 0,0,5 1,16,1 1,97,3 0,97,3 0,81,8 0,CD11c только TNF+ 5.51.8 12.2.0,3 0,1 0,2 0,16,3 0,97,9 1,7 98,3 1,82,5 0,Katushka Katushka CD11c Рис.2 Анализ экспрессии TNF и репортерных белков клетками лимфоидных органов в ответ на стимуляцию ЛПС in vitro. А. Представлены типичные точечные диаграммы, отражающие процентный состав/фенотип клеток миелоидного ряда (наверху) и процентный состав/фенотип клеток, экспрессирующих TNF в ответ на ЛПС (внизу), в селезенках мышей дикого типа и линии KatTNF. Б. Анализ экспрессии TNF и Katushka в спленоцитах после стимуляции ЛПС. Ко-экспрессия TNF и красного белка в спленоцитах Kat-TNF мышей показана черной стрелкой. В. Двумерные графики, отражающие ко-экспрессию красного и зеленого репортерных белков в спленоцитах линии двойных-репортерных мышей (черные стрелки) после стимуляции ЛПС. Серой стрелкой показана базальная экспрессия eGFP. Цифрами указан процент клеток в соответствующем квадранте.
Параллельно были проанализированы спленоциты из двойных Kat*eGFP-TNF репортерных мышей, в которых TNF-экпрессирующие клетки помечены не только красным, но и зеленым белком. В результате была обнаружена выраженная базальная экспрессия eGFP в спленоцитах еще до стимуляции (рис. 2В, серая стрелка). После стимуляции ЛПС интенсивность eGFP в клетках заметно возрастает, превышая базальную экспрессию eGFP (в +ЛПС +ЛПС -ЛПС -ЛПС TNF eGFP CD11b CD11b дальнейшем eGFPhigh популяция). Более того, эти eGFPhigh клетки ко-экспрессируют и белок Katushka (рис. 2В, черная стрелка) в подтипах клеток, для которых характерна экспрессия TNF. Таким образом, в системе in vitro представляется возможным детектировать TNF-экспрессирующие клетки миелоидного ряда по продукции флуоресцентных белков в обеих линиях репортерных мышей.
3. Особенности экспрессии TNF и репортерных белков в культурах костномозговых макрофагов in vitro.
Культуры костномозговых макрофагов являются удобной и распространенной модельной системой для изучения регуляции экспрессии TNF на уровнях транскрипции и трансляции в ответ на TLR4 агонисты (Foster, Nature,2007; Ivashkiv, EJI, 2011).
Б.
A.
0ч 0ч 1ч 1ч 3ч 3ч 6ч 6ч 8ч 8ч Тг-TNF+/- Тг+TNF+/-Тг+TNF-/- Тг-TNF+/- Тг+TNF+/-Тг+TNF-/В.
0ч 1ч 3ч 6ч 8ч Тг-TNF+/- Тг+TNF+/-Тг+TNF-/Рис.3 Особенности регуляции экспрессии гена TNF, кодируемого трансгенной вставкой, in vitro в культурах костномозговых макрофагов. А. Кинетика продукции мРНК гена TNF костномозговыми макрофагами в ответ на стимуляцию ЛПС. Б. Продукция мРНК гена Katushka костномозговыми макрофагами после стимуляции ЛПС. В. Кинетика накопления белка TNF в среде от макрофагов, с указанным генотипом, после стимуляции ЛПС. ч. - час, количества мРНК были нормализованы на количества мРНК -актина.
Чтобы охарактеризовать транскрипционную регуляцию и оценить продукцию TNF, кодируемого трансгенной вставкой независимо от эндогенных аллелей, мыши Kat-TNF были скрещены с мышами, дефицитными по TNF (Kuprash, EJI, 2005). Для получения культур Количества Кколичества копий мРНК TNF копий мРНК Katushka TNF (пг/мл) костномозговых макрофагов использовались гемизиготы по трансгенной вставке, имеющие один аллель TNF дикого типа (Tг+TNF+/-); гемизиготы по трансгенной вставке на генетической основе TNF-дефицитных мышей (Tг+TNF-/-) и мыши с делецией одного аллеля TNF (Tг-TNF+/-). Как видно из графика на рис. 3А, относительные количества транскриптов мРНК трансгенного TNF и TNF дикого типа имеют схожую кинетику экспрессии с пиком через 1 час после активации ЛПС (100нг/мл), что соответствует опубликованным данным (Kontoyiannis D, Immunity, 1999). Одинаковые количества мРНК Katushka в макрофагах Tг+TNF+/- и Tг+TNF-/- говорят о том, что экспрессия мРНК с трансгенной вставки не зависит от наличия или отсутствия эндогенных аллелей TNF (Рис.3Б). Снижение транскрипции трансгенного TNF может быть связано как с активностью только одной копии трансгена, так и с мозаичной экспрессией трансгена в гомогенной культуре клеток. Количество иммунореактивного TNF в супернатантах от макрофагов Тг+TNF-/- было сильно снижено по сравнению с макрофагами TNF+/-. Непропорциональное снижение синтеза трансгенного TNF будет обсуждено ниже.
Тг+TNF+/- Тг+TNF-/A. Tг-TNF+/В.
21,66,3 89,20,27,2 1,Katushka Тг+TNF+/+ Tг-TNF+/- Тг+TNF-/Б.
19,7 77,9 1,95,10,6 88,eGFP TNF Katushka Рис.4 Особенности экспрессии TNF и репортерных белков в культурах косномозговых макрофагов in vitro. А. Точечные диаграммы, отражающие типичный процент TNF и Katushka экспрессирующих костномозговых макрофагов (показано черной стрелкой) указанного генотипа после стимуляции ЛПС в течение 9ч. с добавлением брефельдина А. Б. Экспрессия красного флуоресцентного белка в костномозговых макрофагах указанного генотипа после стимуляции ЛПС в течение 24 ч. с добавлением брефельдина А. В. Кинетика изменения интенсивности свечения зеленого репортерного белка и количества внутриклеточного TNF после стимуляции ЛПС. Базальный уровень eGFP показан пунктиром. СЗИФ - средние значения интенсивности флуоресценции, нормализованные на СЗИФ негативного окрашивания в соответствующем канале детекции. ч.-час Затем был осуществлен анализ экспрессии красного белка в культуре костномозговых макрофагов после стимуляции ЛПС на проточном цитофлуориметре. Макрофаги выдерживались в течение 9 часов в присутствии брефельдина А (5мкг/мл). Живые клетки + ЛПС + ЛПС TNF уровни СЗИФ CD11b были помечены зеленым витальным красителем CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester).
Оказалось, что только часть макрофагов, экспрессирующих TNF, спустя 9 часов после начала стимуляции, помечена белком Katushka (рис.4A, показана стрелкой). Однако, спустя 24 часа после начала стимуляции, количество клеток, помеченных красным репортерным белком, заметно возрастает (рис. 4Б). Совместно с данными транскрипционного анализа (рис.3A) данные проточной цитофлуориметрии указывают на запаздывание кинетики появления Katushka+ клеток относительно кинетики биосинтеза эндогенного TNF. Это может быть обусловлено параметрами биосинтеза флуорохрома со сложной мРНК Kat-TNF или замедленной скоростью созревания флуорохрома красного белка. Более того, заниженные количества трансгенного TNF в супернатантах от макрофагов можно объяснить замедленной трансляцией мРНК Kat-TNF. Тем не менее, замедленная скорость репортирования в условиях хронической патологии не должна быть помехой для детекции TNF-экспрессирующих клеток.
Макрофаги из eGFP-TNF репортерной линии мышей уже без стимуляции экспрессируют флуоресцентный белок (рис. 4В, пунктирная линия), что, скорее всего, происходит из-за отсутствия AU - богатых участков в 3Т-нетранслируемой области (Kontoyiannis, Immunity, 1999). Тем не менее, анализ кинетики экспрессии eGFP в ответ на стимуляцию ЛПС показал, что содержание eGFP заметно повышается в ответ на стимул и отражает, правда с небольшим запаздыванием, кинетику продукции TNF как показано на графике на рис.4В.
4. TNF, экспрессируемый с трансгенной вставки в Kat-TNF мышах, является биологически неактивным.
Как было упомянуто выше, TNF, экспрессируемый с трансгенной вставки, имеет дополнительные 19 аминокислот на С-конце. Известно, что С-конец TNF важен для формирования биологически активных тримеров цитокина (Eck J.M., J Biol Chem, 1989) и, соответственно, для эффективной передачи сигнала через TNFРр55 и TNFРр75 (Tartaglia LA, J.Biol.Chem., 1992).
Для оценки биологической активности TNF, экспрессируемого с трансгенной вставки, использовалась линия мышей Kat-TNF на генетическом фоне TNF-дефицитных мышей (Tг+TNF-/-). Для in vitro теста цитотоксичности TNF дикого типа и трансгенного TNF, супернатанты от стимулированных ЛПС макрофагов из Tг+ TNF-/- и TNF+/- мышей инкубировались с клетками WEHI 164 (клон 13) в течение суток. Анализ количества живых клеток показал сниженную цитотоксичность трансгенного TNF (рис.5А). Более того, фенотип наивных Tг+TNF-/- мышей полностью соответствовал фенотипу TNF-дефицитных мышей - в селезенках взрослых мышей не созревали кластеры фолликулярных дендритных клеток (рис.5Б). Отсутствие биологической активности трансгенного TNF было также подтверждено в модели TNF-зависимого септического шока, индуцированного ЛПС (мкг/мышь) совместно с D-галактозамином (20мг/кг) (Galanos C., PNAS, 1979): когда концентрация трансгенного TNF в сыворотке составляла летальную для ЛПС/Dгалактозамин индуцированной токсичности дозу 10нг/мл (данные не приведены), все мыши Тг+TNF-/- выживали (рис. 5В).
Tг+ TNF-/TNF дикого типа Tг- TNF-/А. Б.
1,0,0,0,0,0,01 0,1 1 10 100 1000 Tг+ TNF+/Tг- TNF+/+ TNF пг/мл TNF дикого типа TNF + блокирующие TNF антитела (30мкг/мл) антитела против TNF (30мкг/мл) трансгенный TNF 1,0,В.
0,0,0,0,01 0,1 1 10 100 10TNF пг/мл трансгенный TNF TNF+ блокирующие TNF антитела (30мкг/мл) антитела против TNF (30мкг/мл) Tг- TNF-/-Tг+TNF-/- Tг-TNF+/- Tг-TNF+/+ 4/4 4/0/2 0/Рис.5 Кодируемый трансгенной вставкой TNF является биологически неактивным. А. Анализ цитотоксичности TNF дикого типа и трансгенного TNF. Б. Иммуногистохимическое окрашивание срезов селезенки из наивных мышей на маркер фолликулярных дендритных клеток CR-1 (показано стрелкой). В. График выживаемости мышей разного генотипа после инъекций ЛПС (10мг/мышь) совместно с D-галактозамином (20мг/мл).
Полученные данные свидетельствуют о том, что TNF, кодируемый трансгенной вставкой, биологически неактивен. Поэтому продукция TNF с трансгенной вставки не создаёт нежелательной сверхэкспресии в репортерных мышах, которая могла бы проявиться в некоторых патофизиологических моделях. Формирует ли трансгенный TNF тримеры или же существует в мономерной форме, еще предстоит установить.
5. Характеристика экспрессии флуоресцентных белков и TNF в лимфоцитах репортерных мышей.
TNF из Т-клеток играет роль в антивирусной защите, защите от микобактерий туберкулеза и листерии (вместе с TNF из макрофагов) (Herbein G., Proc.Soc. Exp. Biol. Med, 2000;
CR-доля живых клеток CR-доля живых клеток выживаемость (%) Grivennikov S., Immunity, 2005). В некоторых случаях Т-лимфоцитарный TNF важен при развитии аутоиммунных заболеваний (Kruglov, JI, 2011; Kontoyiannis, JEM, 2002). В Т- и Вклетках TNF экспрессируется конститутивно на уровне, достаточном для поддержания структуры лимфоидных органов, как это было показано на мышах с делецией TNF специфически в Т- и в В- лимфоцитах (Tumanov, Blood, 2010).
Для изучения соответствия экспрессии флуоресцентных белков и экспрессии TNF клетками адаптивной иммунной системы была проанализирована их продукция в Т- и В- клетках из лимфатических узлов репортерных мышей без стимуляции и в условиях стимуляции ФМА(100нг/мл)/Иономицин (1мкг/мл) (рис.6, и данные для В-клеток не приведены).
ФМА/Иономицин представляет собой биохимический аналог активации Т- и В-клеточного рецепторов.
Анализ нестимулированных лимфоцитов из Kat-TNF-репортерных мышей не выявил заметной экспрессии TNF и красного флуоресцентного белка ни в Т-клетках (рис. 6А, Б) ни в В-клетках. Однако, в Kat*eGFP-TNF мышах детектировалась выраженная базальная экспрессия зеленого флуоресцентного белка, как в Т-лимфоцитах (рис. 6 В, серая стрелка) так и в В-лимфоцитах. Причины появления базальной флуоресценции eGFP в нестимулированных иммуноцитах будут рассмотрены в следующей главе.
СD3+ T-клетки СD3+ T-клетки СD3+ T-клетки А.
Б.
В.
дикий тип Kat-TNF Kat*GFP-TNF 15,8 37,69,23,6 22,19,47,0 0,5 23,6 18,0,52,3 49,2 8,CD0,2 0,51,7 48,0,7 0,0,9 0,97,99,0 0,2 1,Katushka eGFP Рис.6 Характеристика экспрессии репортерных белков и TNF в CD3+ T-клетках из репортерных мышей. А. Типичный процент Т-клеток в лимфатических узлах из репортерных мышей и мышей дикого типа. Б. Точечные диаграммы, отражающие экспрессию TNF и красного репортерного белка Т-клетками из Kat-TNF мышей без стимуляции и после стимуляции ФМА/Иономицин, в присутствии брефельдина А. Стрелкой показана фракция клеток совместно производящая TNF и Katushka. В. Анализ экспрессии TNF и зеленого репортерного белка в ответ на ФМА/Иономицин в лимфоцитах из двойных репортерных мышей. Фракция клеток, экспрессирующих совместно TNF и eGFP показана черной стрелкой. Серой стрелкой показана базальная экспрессия eGFP. Цифрами указан процент клеток в соответствующем квадранте.
Иономицин Иономицин +ФМА/ +ФМА/ Иономицин Иономицин -ФМА/ -ФМА/ TNF CDTNF На Рис. 6А, Б изображены двумерные графики, отражающие процентное содержание Т- клеток из лимфатических узлов Kat-TNF мышей, производящих TNF и красный репортерный белок после стимуляции ФМА/Иономицином. Из графиков видно, что TNF - экспрессирующая популяция лимфоцитов разделяется на TNF+ и Katushka+TNF+, таким образом, белком Katushka оказывается помечена только часть TNF-производящих Т- клеток (справедливо и для В-клеток). Интересно, что подобный результат был получен и для Kat*eGFP-TNF-репортерных мышей (рис.6В, и данные для В-клеток не приведены). На точечных диаграммах рис.6В та фракция TNF-экспрессирующих Т-клеток, которая помечена зеленым флуоресцентным белком, показана черной стрелкой.
Еще одной особенностью экспрессии eGFP в лимфоцитах Kat*eGFP-TNF мышей является то, что значения интенсивности зеленого свечения после стимуляции не превышают уровня максимальной интенсивности базальной экспрессии eGFP, как в случае с макрофагами (рис.2Б). Не исключено, что это явление связано с разной ролью AU-богатых участков в регуляции в лимфоцитах и миелоидных клетках. То, что eGFP аккумулируется в лимфоцитах в меньшей степени, чем в макрофагах, может помешать отличить стимулированные клетки от нестимулированных, например, при сортировке маркированных TNF-экспресирующих клеток или при микроскопическом анализе.
Таким образом, экспрессия зеленого и красного репортерных белков отражает экспрессию TNF, но только в определенной фракции лимфоцитов в определенный момент времени, что предположительно связано с разной кинетикой экспрессии TNF, eGFP и Katushka. То есть, в то время как некоторые количества эндогенного TNF уже синтезированы, красный флуоресцентный белок и зеленый флуоресцентный белок только начинают экспрессироваться, либо с неким опозданием происходит созревание флуорохрома в составе маркерных белков.
6. Выраженная базальная экспрессия eGFP коррелирует с транскрипцией TNF.
Анализ наивных Kat*eGFP -TNF мышей показал базальную экспрессию eGFP в лимфоцитах (рис.6В и данные не приведены). Наблюдаемый эффект можно объяснить тем, что флуоресцентным белком метятся В- и Т-клетки, которые гомеостатически производят TNF, необходимый для поддержания микроархитектуры вторичных лимфоидных органов. С другой стороны, не все регуляторные элементы были включены в конструкцию для eGFPTNF линии мышей, а именно отсутствует AU-богатый участок в 3Т-нетранслируемой области. В работах лаборатории Дж. Коллиаса было показано, что при удалении AUбогатого участка в 3Т-нетранслируемой области гена TNF, пропорционально (линейно) увеличивается экспрессия мРНК цитокина, увеличивается трансляция белка (иногда без стимуляции), так же происходит незначительная эктопическая экспрессия цитокина (Kontoyiannis D, Immunity, 1999). Дальнейшей задачей стало выяснить, насколько выраженная базальная экспрессия eGFP отражает синтез TNF в наивных мышах при нарушенной регуляции трансгенной вставки.
Для характеристики базальной экспрессии TNF и зеленого белка в лимфоцитах, из пула CD4+ Т-клеток eGFP-TNF мышей были очищены разные по интенсивности зеленой флуоресценции подгруппы клеток. Были получены: УeGFPnegФ - популяция без зеленой флуоресценции; две УeGFPint1Ф и УeGFPint2Ф группы с промежуточной интенсивностью свечения eGFP, и УeGFPhighФ - популяцию с высокой интенсивностью флуоресценции зеленого репортерного белка. После анализа уровня транскрипции гена TNF и зеленого флуоресцентного белка, оказалось, что в eGFPhigh популяции экспрессируется больше всего TNF мРНК и мРНК eGFP (рис.7А). Таким образом, данные на рис.7А показывают линейную корреляцию активности транскрипции TNF и активности транскрипции eGFP, которая, в свою очередь, соответствует интенсивности свечения eGFP.
А. CD4+ T-клетки 0.016 0.00.00.00neg high int1 int0.00.00.0.008 0.0020,0 29,1 16,5,0.00.00.00.000.00 neg int1 int2 high neg Int1 Int2 high eGFP CD44-CD62L+ TхTхCD44+ CD62LB.
дт ст нест нест ст Б. CD4+ T-клетки CD44+CD62L+ 3,83,10,CD44 eGFP eGFP Рис.7 Базальная экспрессия eGFP коррелирует с транскрипцией TNF в наивных мышах. A. На точечной диаграмме показана стратегия выделения отдельных субпопуляций CD4+ Т-клеток отличающихся по интенсивности eGFP. На графиках представлен анализ количеств транскриптов мРНК TNF и мРНК eGFP. Количества мРНК были нормализованы на количества мРНК -актина Б. Стратегия выделения популяций Т-клеток представлена на точечной диаграмме. Распределение интенсивности eGFP в разных субпопуляциях Т-клеток показано на гистограмме. В. На гистограмме отражено распределение интенсивности eGFP в разных субпопуляциях Т-клеток, без стимуляции и после стимуляции ФМА/Иономицин. Тх1 - Т-хелперные клетки 1 типа, Тх2 - Т-хелперные клетки 2 типа.
CDуровни мРНК eGFP уровни мРНК TNF %Max %Max CD62L Параллельно, была проанализирована картина экспрессии eGFP в разных популяциях суммарных CD4+ Т-клеток из лимфоидных органов eGFP-TNF мышей. Как видно из рис.7Б, средние значения интенсивности флуоресценции зеленого белка неравномерно распределены среди разных видов Т- клеток. Эффекторные (СD44+CD62L-) и центральные (СD44+CD62L+) CD4+ Т-клетки памяти производят больше eGFP, чем наивные Т-клетки, что соответствует их способности немедленно и эффективно производить TNF при повторной встрече с антигеном. Такая специфичность в интенсивности синтеза зеленого флуоресцентного белка разными популяциями еще раз указывает на то, что уровень eGFP отражает интенсивность транскрипции мРНК TNF.
Дополнительным аргументом в пользу того, что интенсивность eGFP отражает потенциальную способность клеток производить мРНК TNF, является анализ поляризованных in vivo Т-хелперных (Тх) клеток 1-го и 2-го типа (рис.7В). Базальная интенсивность флуоресценции eGFP в Тх2 клетках воспроизводимо на порядок ниже, чем в Tх1 клетках. Из литературы известно, что Тх2 клетки производят значительно меньше TNF (Chiang E, Nat. Med.,2009) и TNF мРНК (Cherwinski et al. J.E.M. 1987), чем Тх1.
Механистически, в геноме Тх1 и Тх2 при поляризации (под управлением транскрипционных факторов T-bet и GATA3, соответственно) происходит ряд эпигенетических модификаций, что, по-видимому, приводит к стойким различиям в активности транскрипции гена TNF в двух субпопуляциях Т-клеток.
Суммируя все сказанное, можно предположить, что интенсивность свечения eGFP отражает интенсивность транскрипции TNF в клетках из наивных неиммунизованных мышей. В результате Kat*eGFP-TNF модель позволяет увидеть сигнал репортерного белка в тех клетках, в которых при наличии всех регуляторных элементов интенсивность транскрипции гена TNF невелика. Фактическая экспрессия цитокина такими клетками в каждом случае требует экспериментальной проверки.
7. л Гомеостатическая экспрессия репортерных белков.
В работах Б. Бойтлера в начале 90-х годов прошлого столетия с использованием CAT-TNF репортерной модели была выявлена экспрессия TNF в тимусе из наивных мышей.
Дальнейшие исследования показали, что TNF преимущественно экспрессируется в корковом слое тимуса на стадиях дифференцировки двойных негативных предшественников (Double Negative, DN). Во время созревания DN тимоциты проходят несколько стадий, охарактеризованных определенным сочетанием антигенных маркеров на поверхности клеток: DN1=CD44+CD25-, DN2=CD44+CD25+, DN3=CD44-CD25+, DN4=CD44-CD25(рис.8А). В работе Godfrey D, JI, 1993 было определено, что на разных стадиях созревания тимоциты имеют разную потенциальную способность экспрессировать белок TNF после стимуляции ФМА/Иономицин: DN1>DN2>DN3>DN4. В работе нашей лаборатории Liepinsh,EJI 2009 была продемонстрирована аналогичная корреляция продукции мРНК TNF на стадиях созревания лимфоцитов и биологическая роль белка TNF при переходе клеток коры тимуса из DN1 в DN2.
При анализе тимоцитов из Kat*eGFP-TNF мышей выяснилось, что интенсивность eGFP на стадиях созревания DN популяции тимоцитов коррелирует со способностью клеток экспрессировать мРНК TNF. В свою очередь, экспрессия красного репортерного белка не детектировалась в тимоцитах из Kat-TNF мышей при анализе методом проточной цитофлуориметрии (данные не приведены). Таким образом, при анализе экспрессии TNF в тимусе репортерная система Kat-TNF имеет меньшую чувствительность, чем Kat*eGFPTNF.
84,0 16,5 13,А. 10,DN1 DNDN 2,2,18,5 52,DN4 DNCD4 CD120.0 Б.
В.
100.80.0 60.40.0 20.0.DNDN1DN2DN3 конт дикий тип Kat-TNF Рис.8 Гомеостатическая экспрессия eGFP и Katushka в наивных репортерных мышах. А.
Точечные диаграммы демонстрируют стратегию выделения двойной негативной фракции тимоцитов (DN). Цифрами указан типичный процентный состав популяций тимоцитов. Б. На графике приведены значения СЗИФ на стадиях созревания тимоцитов, нормализованные на интенсивность eGFP негативных клеток. В. На графике приведен процент % Katushka+ клеток среди CD4+CD44+CD62L- Тклеток, выделенных из пейеровых бляшек.
Регуляция экспрессии TNF в кишечнике в норме и ее изменение при патологиях является предметом активного изучения, поскольку её нарушение е приводит к развитию ряда воспалительных заболеваний (болезни Крона, язвенного колита). Следует отметить, что клетки слизистой кишечника (в отличие от клеток из вторичных лимфоидных органов) находятся в условиях постоянной стимуляции пищевыми антигенами и продуктами бактериальной флоры кишечника (Suzuki K, Annu.Rev.Immunology, 2009). При исследовании CDCD+ уровни CЗИФ eGFP % Katushka клеток клеток пейеровых бляшек (ПБ) кишечника Kat-TNF мышей удалось обнаружить экспрессию красного репортерного белка в активированных Т-клетках (рис.8В). Способность клеток пейеровых бляшек спонтанно экспрессировать провоспалительные цитокины была показана в ряде других работ (Monteleone G, JI, 2003).
В результате, на примере тимуса и ассоциированной с кишечником лимфоидной ткани было продемонстрировано, что обе линии репортерных мышей в дальнейшем могут быть использованы для изучения физиологии TNF в наивных, неиммунизованных мышах с использованием методов проточной цитометрии.
В Kat*eGFP-TNF мышах гистологически была выявлена компартментализация eGFP+ клеток. Однако, в связи с ограничениями чувствительности методов микроскопии, видны только самые яркие клетки-продуценты eGFPhigh. В селезенках eGFPhigh клетки преимущественно расположены в Т-клеточной зоне, тогда как в В-клеточной зоне клетки имеют менее интенсивную зеленую флуоресценцию ( рис. 9А, верхняя панель). Интересно, что яркие клетки из Т- клеточных зон не являются CD3+ Т-лимфоцитами (рис.9А, в центре, желтая стрелка), их фенотип необходимо уточнить дополнительно - судя по морфологии, это могут быть дендритные клетки, клетки стромы или макрофаги.
Фенотип клеток, меченых eGFP в ПБ отличается от такового в селезенках. Большое сосредоточение eGFPhigh клеток опять же приходится на Т-клеточные зоны ПБ (рис. 9A, нижняя панель), однако CD3+ Т-клетки оказываются помечены зеленым репортерным белком (рис. 9A, в центре белые стрелки). Кроме того, В-клетки имеют более высокую экспрессию зеленого флуоресцентного белка (рис. 9A, справа), чем в селезенке (рис. 9А, верхняя панель)., Повышенный синтез eGFP и, предположительно, активность транскрипции TNF в Т- и В-клетках из ПБ соответствует их более активированному состоянию, по сравнению с лимфоцитами из селезенок. На рис.9Б показано, что сильными eGFP-продуцентами являются также клетки, индуцирующие развитие лимфоидных тканей (lymphoid tissue inducer cells, LTIC) с фенотипом Thy+CD3-B220- LTIC, сосредоточенные в лимфоидных бляшках оснований крипт. Приведенные данные подтверждает активную транскрипцию TNF LTIC собственной пластинки слизистой кишечника взрослых мышей (Tsuji M., Immunity, 2008). Важно отметить, что Katushka не детектировалась микроскопически в органах из наивных Kat-TNF мышей (данные не приведены). Наши гистологические данные говорят о том, что Kat*eGFP-TNF репортерная модель является инструментом для скрининга TNF-экспрессирующих клеток в наивных мышах методами микроскопии, которые особенно важны для изучения стромальных компонентов. Однако при таком анализе необходимо учитывать нарушения регуляции eGFP и подтверждать экспрессию TNF другими методами. Совокупность гистологических данных, полученных при анализе кишечника Kat*eGFP-TNF мышей, и данные проточной цитофлуориметрии лимфоцитов из пейеровых бляшек Kat-TNF мышей позволяют сделать вывод о том, что Тклетки из пейеровых бляшек кишечника гомеостатически производят TNF, не вызывающий спонтанного воспаления.
общий вид Т-клеточная зона В-клеточная зона А.
T B B T GFPB220CD3 B - В-клеточная зоная T - Т-клеточная зона Б.
GFP GFPB220ThyGFPСD3ThyРис.9 Иммунофлуоресцентный гистологический анализ eGFPhigh клеток на срезах органов двойных-репортерных мышей. А. иммунофлуоресцентный анализ срезов селезенок(верхняя панель) и пейеровых бляшек (нижняя панель) перечислено слева-направо: общий вид, Т-клеточная зона, В-клеточная зона Б. иммунофлуоресцентный анализ бляшек оснований крипт, перечислено слева-направо: общий вид распределение eGFP экспрессирующих клеток в собственной пластинке кишечника и в бляшках оснований крипт,GFP производится в Thy+CD3- клетках, GFP производится в Thy+B220- клетках.
селезенка пейеровы бляшки крипт бляшки оснований 8.Характеристика репортерных Kat-TNF мышей in vivo.
Для того, чтобы охарактеризовать экспрессию TNF и репортерного белка в Kat-TNF линии in vivo, были использованы модели, в которых TNF является основным патогенным фактором: модель септического шока, вызванного инъекцией бактериального эндотоксина (ЛПС, 50 мкг/мышь) и КонА (20 мг/кг) - опосредованной гепатотоксичности. Данные по Кон A-индуцированной гепатотоксичности приведены в главе 8 полного текста диссертации.
Продукция патогенного TNF в этих моделях была ранее охарактеризована в нашей лаборатории (Grivennikov S, Immunity, 2005). В частности, было показано, что при ЛПСтоксичности TNF, производимый макрофагами/нейтрофилами, играет патогенную роль.
На рис.10А приведены точечные диаграммы, отражающие совпадение экспрессии TNF и красного репортерного белка в клетках селезенки в ответ на системное введение ЛПС (показано стрелкой). Клетки селезенки выделялись через час после индукции эндотоксического шока и для накопления детектируемых количеств TNF в эндоплазматическом ретикулуме инкубировались в течение 6 часов вместе с брефельдином А (5 мкг/мл) in vitro.
А.
клетки инкубировались с Брефельдином А в течение 5 часов TNF -дефицитные дикий тип (ЛПС) Kat ЦTNF (ЛПС) Kat-TNF(ФБ) мыши (ЛПС) 0,6 0,0,4 0,0,8 0,0,0,0,1 98,7 98,4 0,0,0,99,99,Katushka 1. CD11b+Ly6Chigh 2. CD11bhighLy6Clow 3. CD11b+Ly6Clow воспалительные нейтрофилы макрофаги макрофаги Б.
2.
3.
1.
дикий тип Katushka живые клетки Kat-TNF Ly6C Рис.10 Характеристика репортерных Kat-TNF мышей in vivo. А. Точечные диаграммы, характеризующие экспрессию TNF и красного репортерного белка клетками селезенки после введения ЛПС мышам указанного генотипа. Клетки селезенки инкубировались с брефельдином А в течение 5 часов. Б. Анализ фенотипа клеток, экспрессирующих Katushka, среди свежевыделенных спленоцитов, через час после инъекций ЛПС. Стрелками указана продукция красного флуоресцентного белка. ФБ - фосфатный буфер TNF CD11b %Max В свою очередь, анализ живых клеток селезенки, выделенных через час после внутрибрюшинных инъекций ЛПС, который представлен на рисунке 10Б, позволил определить фенотип Katushka- экспрессирующих клеток. Флуорохромом были специфически маркированы нейтрофилы (CD11b+Ly6Clow) и воспалительные макрофаги (CD11b+Ly6Chigh), которые соответствуют TNF-экспрессирующим популяциям. Эти клеточные субпопуляции, поскольку остаются живыми, могут быть выделены и использованы для транскриптомного анализа.
В другой in vivo модели экспериментального энцефаломиелита, в которой TNF играет защитную роль, анализ Kat-TNF мышей проводился методом двухфотонной микроскопии.
Микроскопическое исследование в спинном мозге живых экспериментальных животных позволило наблюдать подвижные клетки в составе воспалительных инфильтратов, которые были помечены красным флуоресцентным белком. Таким образом, Kat-TNF репортерная линия мышей позволяет наблюдать динамику, распределение и межклеточные контакты маркированных красных флуоресцентным белком TNF-продуцентов in vivo. Дальнейшие наблюдения за динамикой красных клеток и характеристика фенотипа этих клеток предстоит в будущем.
В результате Kat-TNF модель позволяет достоверно определить клетки, экспрессирующие TNF in vivo. Более того, отсутствие базальной экпрессии красного репортерного белка в KatTNF мышах позволяет с большей точностью, чем в eGFP-TNF репортерной модели, определить индуцированную экспрессию TNF, что делает эту модель оптимальной для микроскопии in vivo.
ВЫВОДЫ 1. Получены и охарактеризованы две новых линии TNF-репортерных мышей, с красным белком Katushka и двойные репортерные мыши с красным и зеленым флуоресцентными белками Kat*eGFP-TNF.
2. Анализ миелоидных клеток обеих линий репортерных мышей показал достоверное маркирование TNF-экспрессирующих клеток флуоресцентными белками после активации ЛПС. При этом регистрировалась нормальная транскрипционная регуляция продукции мРНК Kat-TNF в культурах костномозговых макрофагов.
3. По экспрессии флуоресцентных белков определяется фракция TNF-экспрессирующих лимфоцитов из обеих линии репортерных мышей. Детекция флуоресцентных белков только в части трансгенных лимфоцитов связана с разной кинетикой экспрессии флуоресцентных белков и цитокина.
4. TNF, кодируемый трансгенной вставкой Kat-TNF, является биологически неактивным.
Нарушение биологической активности происходит в результате присоединения 2А-пептида на С-конец белка, который важен для взаимодействия с рецептором цитокина. Поэтому KatTNF мыши продуцируют нормальные уровни биологически активного TNF.
5. Интенсивность базальной флуоресценции eGFP в иммуноцитах из неиммунизованных, наивных eGFP-TNF мышей отражает активность транскрипции гена TNF в разных клеточных субпопуляциях.
6. Т-клетки из Пейеровых бляшек в наивных, неиммунизованных мышах конститутивно производят TNF. Модель Kat*eGFP-TNF пригодна для гистологического скрининга TNFэкспрессирующих клеток в наивных неиммунизованных мышах.
7. TNFЦэкспрессирующие клетки детектируются по экспрессии флуоресцентного белка Katushka в in vivo моделях с Kat-TNF мышами при помощи проточной цитофлуориметрии и двухфотонной микроскопии.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи 1) Кучмий А.А., Круглов А.А., Галимов А.Р., Шебзухов Ю.В., Чудаков Д.М., Лукьянов С.А., Недоспасов С.А. Новая линия трансгенных репортерных мышей для изучения экспрессии Фактора Некроза Опухолей // Российский имунологический журнал, Том5(14), №3-4, 2011, с.20522) Kruglov A.A., Kuchmiy A.A., Grivennikov S.I., Tumanov A.V., Kuprash D.V., Nedospasov S.A.
Physiological functions of tumor necrosis factor and the consequences of its pathologic overexpression or blockade: mouse models // Cytokine Growth Factor Rev. 2008 Jun-Aug;19(34):p231-44.
3) Liepinsh D.J., Kruglov A.A., Galimov A.R., Shakhov A.N., Shebzukhov Y.V., Kuchmiy A.A., Grivennikov S.I., Tumanov A.V., Drutskaya M.S., Feigenbaum L., Kuprash D.V., Nedospasov S.A.
Accelerated thymic atrophy as a result of elevated homeostatic expression of genes encoded by TNF\lymphotoxin cytokine locus // Eur J Immunol. 2009 39(10):2906-15.
4) Kruglov A.A., Tumanov A.V., Grivennikov S.I., Shebzukhov Y.V., Kuchmiy A.A., Efimov G.A., Drutskaya M.S., Scheller J., Kuprash D.V., Nedospasov S.A. Modalities of experimental TNF blockade in vivo: mouse models // Adv Exp Med Biol. 2011;691:421-31.
Тезисы конференций 1) Kuchmiy A.A., Kruglov A.A., Kuprash D.V., Chudakov D.M.,. Lukyanov S.A, Nedospasov S.A.
New TNF reporter mouse with red fluorescent protein Katushka. 13th international TNF conference:
TNF2011. Hyogo, Japan, May 15-18, 2011.
Благодарности Работа была выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология".