Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Горященко Александр Сергеевич
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРАСНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ СОЗДАНИЯ СЕНСОРОВ, ОСНОВАННЫХ НА ИНДУКТИВНО-РЕЗОНАНСНОМ ПЕРЕНОСЕ ЭНЕРГИИ
Специальность 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
МОСКВА 2012
Работа выполнена в лаборатории физической биохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Научный консультант:
доктор химических наук, профессор Александр Павлович Савицкий
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор, зав. лабораторией физиологически активных биополимеров Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института элементоорганических соединений им. В.Н. Несмеянова РАН Игорь Александрович Ямсков доктор биологических наук, зав. лабораторией биофотоники Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Константин Анатольевич Лукьянов
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
Защита состоится л25 декабря 2012 г. в л15 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В, Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан л23ноября 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук И.К. Сакодынская ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Развитие методов геномики и протеомики позволило определить первичную структуру и пост-трансляционную модификацию большого числа белков и ферментов. В настоящее время актуальной задачей является изучение функционирования белков и ферментов непосредственно в живых клетках и организмах, поскольку это позволило бы понять, под действием каких факторов и на какой стадии того или иного биологического процесса происходит активация или ингибирование исследуемого фермента. Проведение подобных исследований на живых системах стало возможным в результате развития методов биоимиджинга. Одними из наиболее широко применяемых маркеров для биоимиджинга являются цветные флуоресцентные белки, поскольку они представляют собой генетически кодируемые флуоресцентные метки, которые экспрессируются самими клетками и не требуют изучения фармакокинетики их введения в исследуемые системы. Кроме того, в большинстве случаев цветные флуоресцентные белки не являются токсичными, устойчивы к действию протеаз, а палитра полученных на данный момент цветных белков покрывает практически весь диапазон видимого света Одним из ключевых клеточных процессов, контролируемых группой протеолитических ферментов - каспаз, является апоптоз, или программируемая клеточная гибель. Нарушение регуляции апоптоза приводит к развитию целого ряда тяжелых заболеваний - аутоиммунных, нейродегеративных, патологии системы крови и злокачественным опухолям. Изучение процесса апоптоза позволит понять патогенез этих заболеваний, а в дальнейшем, возможно, разработать новые лекарственные средства.
Центральным ферментом апоптоза является так называемая эффекторная каспаза-3, так как на ней сходятся два пути активации апоптоза - митохондриальный и рецепторный, и кроме того она является основным эффекторным ферментом апоптоза.
Ранее нами был создан биосенсор на каспазу-3, названный TagRFP-23-KFP, который основан на явлении индуктивно-резонансного переноса энергии - FRET. Данный FRET-сенсор обладает флуоресценцией в красной области спектра, что позволяет снизить уровень фоновой флуоресценции, а также увеличивает глубину проникновения возбуждающего света внутрь тканей. Применение практически не флуоресцирующего белка KFP в качестве акцептора позволило решить проблему перекрывания спектров флуоресценции донора и акцептора, кроме того, данный сенсор позволяет детектировать активность каспазы-3 по изменению времени жизни флуоресценции донора, что в отличие от регистрации изменения интенсивности флуоресценции является концентрационно-независимым методом.
Поскольку оптические свойства различных клеточных линий могут существенно различаться, актуальной задачей является оценка возможности детекции активности каспазы-3 с помощью разработанного сенсора TagRFP-23-KFP в различных опухолевых моделях, в частности, имеющих сильную пигментацию.
Важным вопросом также является применимость данного сенсора для детекции ферментативной активности в различных клеточных органеллах. Поскольку значение pH в клеточных органеллах существенно варьируется - от 4,5 в лизосомах до 8,5 в аппарате Гольджи, актуальной задачей является изучение зависимости флуоресцентных свойств компонент разработанного сенсора от значения pH среды.
При использовании KFP в качестве тушителя в сенсоре TagRFP-23-KFP недостатком является способность KFP к разгоранию, то есть существенному увеличению квантового выхода под действием интенсивного зеленого света, что может привести к зависимости флуоресцентных свойств сенсора от мощности возбуждающего излучения. Согласно литературным данным, замена глицина в 148 положении на аспарагин в белке KFP позволяет получить нефлуоресцирующий и не разгорающийся под действием интенсивного зеленого света мутантный белок KFP-G148N. Однако, свойства указанного мутантного белка изучены лишь качественно, поэтому актуальной задачей является количественная характеристика флуоресцентных свойств белка KFP-G148N и его способности к разгоранию под действием интенсивного зеленого света, а также изучение его физико-химических свойств.
Наконец, новаторским подходом является применение сразу нескольких сенсоров и одновременная детекция активности нескольких ферментов или слежение за какимилибо параметрами клетки. Для этого актуальным является создание и изучение физикохимических и спектральных свойств биосенсора на основе пары дальнекрасных флуоресцентных белков, сигнал которого можно было бы детектировать одновременно с сигналом разработанного сенсора TagRFP-23-KFP.
Цели и задачи работы. Целями настоящей работы было изучение физикохимических и спектральных свойств красных флуоресцентных белков и создание на их основе FRET-сенсоров для детекции активности каспазы-3.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. продемонстрировать возможность детекции активности каспазы-3 с помощью сенсора TagRFP-23-KFP в клетках опухолевой линии B16, обладающих сильной пигментацией;
2. изучить зависимость флуоресцентных свойств белка KFP от значения pH;
3. изучить спектральные и физико-химические свойства белка KFP с заменой G148N;
4. изучить спектральные и физико-химические свойства FRET-сенсора на основе дальнекрасных белков FusionRed и Dedushka;
5. продемонстрировать расщепление сенсора на основе белков FusionRed и Dedushka под действием каспазы-3;
Научная новизна. Была продемонстрирована возможность детекции активности каспазы-3 с помощью сенсора TagRFP-23-KFP в клетках меланомы мыши B16, обладающих сильной пигментацией; по изменению времени жизни флуоресценции TagRFP.
Было показано появление в кислой области pH новых спектральных форм KFP;
первая из них характеризуется поглощением на 450 нм и может быть идентифицирована как фракция с нейтральной формой хромофора, вторая флуоресцирует на 530 нм и ее появление может быть объяснено образованием катионной формы хромофора в результате переноса протона в возбужденном состоянии.
Проведена количественная характеристика флуоресцентных свойств белка KFP с заменой G148N и его способности к разгоранию под действием интенсивного зеленого света, а также показано, что замена G148N приводит к изменению олигомерного состояния KFP с тетрамера на димер. Впервые получен и охарактеризован FRET-сенсор на каспазу-3 на основе дальнекрасных белков FusionRed и Dedushka. Эффективное расщепление субстрата на основе белков FusionRed и Dedushka каспазой-3 in vitro показано по изменению параметров флуоресценции и электрофоретическим методом.
Практическая значимость. Установленная зависимость спектральных свойств KFP от pH позволяет оценить возможность его использования для создания сенсоров, имеющих локализацию в различных клеточных компартментах. Замена G148N в белке KFP позволяет уменьшить его олигомеризацию, что дает возможность уменьшить олигомеризацию биосенсоров на основе красных флуоресцирующих белков. Созданные генно-инженерные конструкции на основе двух красных и двух дальнекрасных флуоресцирующих белков дают возможность регистрации ферментативной активности каспазы-3, а в перспективе - использовать пару разработанных биосенсоров для одновременного мониторинга активности двух различных каспаз.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (202 ссылки). Диссертация содержит 1страницы печатного текста, включает 68 рисунков и 3 таблицы.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных и российских конференциях: Школаконференция Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины (Москва, 2010), третья международная научно-практическая конференция Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине (СанктПетербург, 2012), Programmed Cell Death in Biology and Medicine (Москва, 2012), IV Съезд биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), 20th International Conference on Advanced Laser Technologies ALTТ12 (Thun, Switzerland, 2012), Russian-Chinese Workshop on Biophotonics and Biomedical Optics (Saratov, Russia, 2012).
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Характеристика клеточной линии В16-TR23K Ранее созданный в нашей лаборатории FRET-биосенсор на каспазу-3 TagRFP-23KFP был успешно опробован на модели клеток аденокарциномы легкого человека и позволил детектировать активность каспазы-3 по изменению времени жизни флуоресценции донора.
Однако, оптические свойства различных клеточных линий могут существенно различаться. В частности, в линиях, имеющих сильную пигментацию, детекция сигнала сенсора по изменению интенсивности флуоресценции сильно затруднена или вообще невозможна, поэтому возможность применения сенсора TagRFP-23-KFP и метода детекции по изменению времени жизни флуоресценции донора решено было опробовать на модели опухолевой линии меланомы мыши B16, имеющих сильную пигментацию.
иния клеток В16-TR23K, экспрессирующая сенсор TagRFP-23-KFP, была получена путем трансфекции клеток В16 плазмидной ДНК pTR23К методом липосомальной трансфекции.
Флуоресценция клеток клеточной линии В16-TR23K in vitro была подтверждена при помощи флуоресцентной микроскопии. На Рис. 1 приведены микрофотографии опухолевых клеток исходной меланомы В16(А) и флуоресцирующей меланомы В16- TR23K (Б).
А Б Рисунок 1. Получение трансфицированных клеток В16-TR23K. А - меланома В16, Б- меланома В16-TR23K (Nikon-TE2000U, x 20, экспозиция 1с).
Полученное методом FLIM распределение времени жизни флуоресценции клеток B16-TR23K, обработанных цисплатином, продемонстрировало бимодальное распределение средних времен жизни флуоресценции с максимумами 2 и 2,4 нс соотвественно (Рис. 2).
Рисунок 2. Изображение клеток B16-TR23K, обработанных цисплатином, полученное методом FLIM. Внизу приведено распределение средних времен жизни флуоресценции по всему кадру.
Полученное изображение наглядно демонстрирует, что два разных времени жизни флуоресценции возникают из-за наличия двух субпопуляций клеток, обладающих различными временами жизни флуоресценции. В одной субпопуляции (среднее время жизни флуоресценции 1,9-2 нс) клеток время жизни флуоресценции соответствует полученному нами ранее времени жизни флуоресценции нерасщепленного субстрата TagRFP-23-KFP (Рис. 3).
Рисунок 3. Распределение времени жизни флуоресценции клетки B16-TR23K, не содержащей активной каспазы-3 (клетка 1 на Рис. 2).
Другая субпопуляция имеет заметно большее среднее время жизни флуоресценции (2,4 нс). Это время жизни флуоресценции соответствует индивидуальному белку TagRFP, то есть клетки этой субпопуляции подверглись апоптозу и содержат расщепленный субстрат TagRFP-23-KFP (Рис. 4) и таким образом эти клетки содержат активную каспазу3.
Рисунок 4. Распределение времени жизни флуоресценции клетки B16-TR23K, содержащей активную каспазу-3 (клетка 2 на Рис. 2).
Таким образом, нами продемонстрирована возможность детекции активности каспазы-3 в живых клетках пигментированной меланомы мыши В16, экспрессирующей FRET-сенсор на каспазу-3 TagRFP-23-KFP, методом FLIM.
2. Свойства KFP в кислой области pH 2.1. Спектрально-флуоресцентные свойства KFP в кислой области pH Зависимость начальной флуоресценции KFP от pH имеет характерную куполообразную форму. При низких значениях pH флуоресценция белка падает, что говорит о его денатурации. По мере увеличения pH начальная флуоресценция KFP возрастает, достигая максимума при pH 4,3, после чего вновь падает, причем при pH 7,она практически нулевая, что соответствует переходу белка в нефлуоресцирующее состояние (Рис. 5), тогда как при pH выше 9, как было показано ранее, наблюдается существенное увеличение интенсивности флуоресценции, причем данное явление является полностью обратимым как при щелочных, так и при кислых значениях pH.
Рисунок 5. Зависимость интенсивности флуоресценции KFP в начальный момент времени от pH в буфере 0.1М CH3COONa, 0.2 M CH3COONH4. Возбуждение флуоресценции на 530 нм, детекция - на 590 нм.
Спектр поглощения KFP в кислой области pH демонстрирует падение поглощения на 560 нм с течением времени, в то время как на 450 нм появляется новая полоса поглощения (Рис.6).
0 минут 10 минут 20 минут 0,0 минут 30 минут 40 минут 0, 50 минут 60 минут 70 минут 0, 80 минут 90 минут 0,04 100 минут 120 минут 110 минут 120 минут 0,0,-0,400 450 500 550 600 650 7Длина волны, нм Рисунок 6. Временная зависимость спектра поглощения KFP в буфере 0.1М CH3COONa, 0.2 M CH3COONH4, pH 4,5.
Поглощение Спектр возбуждения флуоресценции KFP также показывает увеличение интенсивности флуоресценции белка с течение времени, причем помимо основного пика возбуждения на 560 нм появляется новый, ранее неизвестный пик - на 450 нм. (Рис. 7), 0 минут 10 минут 2 20 минут 30 минут 180 120 минут 40 минут 50 минут 1 60 минут 70 минут 1 80 минут 1 90 минут 100 минут 1 110 минут 120 минут 0 минут 250 300 350 400 450 500 550 6Длина волны, нм Рисунок 7. Временная зависимость спектра возбуждения флуоресценции KFP в буфере 0.1М CH3COONa, 0.2 M CH3COONH4, pH 4,5. Детекция на 590 нм.
Что касается спектров флуоресценции, то при возбуждении флуоресценции на 5нм наблюдается один максимум на 590 нм (Рис. 8), тогда как при возбуждении флуоресценции на 455 нм помимо основного максимума (590 нм) появляется еще один - на 530 нм, ранее не описанный (Рис. 9).
0 минут 3 10 минут 3 20 минут 120 минут 3 30 минут 3 40 минут 2 50 минут 2 60 минут 2 70 минут 2 80 минут 2 90 минут 1 100 минут 1 110 минут 1120 120 минут 10 минут 560 580 600 620 640 660 680 7Длина волны, нм Рисунок 8. Временная зависимость спектра эмиссии KFP при возбуждении флуоресценции на 530 нм в буфере 0.1М CH3COONa, 0.2 M CH3COONH4, pH 4,5.
Интенсивность флуоресценции Интенсивность флуоресценции 0 минут 10 минут 20 минут 1 30 минут 120 минут 40 минут 1 50 минут 60 минут 70 минут 1 80 минут 90 минут 100 минут 110 минут 120 минут 0 минут 500 550 600 650 7Длина волны, нм Рисунок 9. Временная зависимость спектра эмиссии KFP при возбуждении флуоресценции на 455 нм в буфере 0.1М CH3COONa, 0.2 M CH3COONH4, pH 4,5.
Таким образом, в кислой среде наблюдается увеличение флуоресценции KFP. При этом в спектре поглощения появляется новая полоса - 450 нм, которая согласно результатам квантово-химических расчетов соответствует форме KFP с нейтральным хромофором. При этом в спектре флуоресценции при возбуждении на 455нм наблюдаются 2 пика - 530 и 590 нм. Пик на 590 нм соответствует анионной форме хромофора. Максимум на 530 нм вероятнее всего соответствует форме KFP с катионным хромофором, образующимся в результате процесса переноса протона на атом азота имидазолинонового кольца хромофора в возбужденном состоянии (Рис. 10).
Рисунок 10. Перенос протона на хромофор KFP в возбужденном состоянии.
Интенсивность флуоресценции Такой перенос протона становится возможным благодаря существенному изменению значения pKa атома азота имидазолинонового кольца хромофора в возбужденном состоянии - с кислого (pKa 3,7, основное состояние) на основное ( pKa 8,9, возбужденное состояние), что делает его акцептором протона.
2.2. Изучение кинетического изотопного эффекта Гипотеза о появлении в кислой области pH формы белка, содержащей протонированный хромофор и флуоресцирующей на 530 нм была проверена измерением кинетического изотопного эффекта.
Были получены кинетики затухания флуоресценции KFP при pH 3,94 в H2O и D2O и регистрации на 590 нм (соответствует флуоресценции анионной формы хромофора) и 520 нм (предположительно соответствует флуоресценции катионной формы хромофора) (Рис. 11).
H2O, детекция на 520 нм H2O, детекция на 590 нм 1,0 D2O, детекция на 520 нм D2O, детекция на 590 нм 0,0,0,0,0,2 Время, нс Рисунок 11. Начальные участки кривых затухания флуоресценции KFP в H2O и D2O, pH 3,94. Возбуждение флуоресценции на 405 нм.
Анализ кривых затухания флуоресценции KFP в H2O и D2O показал, что при регистрации на 590 нм кривые затухания совпадают, тогда как регистрация на 520 нм демонстрирует некоторую задержку кинетики затухания образца KFP D2O по сравнению с образцом в H2O.
Различие скорости переноса D+ и H+ от молекулы растворителя на хромофор KFP является причиной различия кинетик затухания флуоресценции в H2O и D2O. Этот результат говорит о наличии кинетического изотопного эффекта, который подтверждает гипотезу о переносе протона в возбужденном состоянии и появлении в возбужденном состоянии протонированной формы хромофора KFP в кислой области pH.
Нормированная флуоресценция 2.3. Кинетики разгорания и тушения флуоресценции KFP Нами было изучено изменение флуоресцентных свойств KFP под действием лазерного излучения с длиной волны 532 нм в кислой области pH. На рис. 12 приведены результаты для pH 4,02.
Разгорание флуоресценции Повтор через 10 минут 14121086420 20 40 60 80 1Время (сек) Рис. 12. Кинетики разгорания флуоресценции KFP при pH 4,02. Возбуждение флуоресценции на 532 нм, регистрация - на 590 нм.
В кислой области pH KFP изначально имеет высокий квантовый выход флуоресценции, и облучение зеленым светом приводит к росту флуоресценции примерно на 10%. Таким образом, при кислых значениях pH образуются интенсивно флуоресцирующие конформации белка, не требующие при этом накачки светом в отличие от классического фотоиндуцируемого разгорания.
Была также исследована кинетика тушения флуоресценции при pH 4,флуоресцирующей формы KFP лазером с длиной волны возбуждения 405 нм.
В начальный момент времени белок облучали зеленым лазером, после чего включали синий лазер при работающем зеленом. Облучение зеленым светом с последующим включением синего (длина волны 405 нм) лазера не приводит к тушению флуоресценции KFP (Рис. 13).
Интенсивность флуоресценции Разгорание флуоресценции Повтор через 10 минут 191817161514131211109876543210 10 20 30 40 50 60 Время (сек) Рисунок 13. Флуоресценция KFP при облучении зеленым лазером (532 нм) с последующим включением синего (405 нм) при pH 4,02. Момент включения синего лазера выражен скачком сигнала. Регистрация флуоресценции на 590 нм.
При облучении образца KFP при pH 4,02 только синим лазером (405 нм) уровень флуоресценции возрастал пропорционально мощности и сохранялся в течение всего эксперимента, причем варьирование мощности облучения не приводило к тушению флуоресценции при регистрации как на 519 нм (Рис.14), так и на 590 нм (Рис. 15).
Мощность лазера 90 мВ Мощность лазера 30 мВ Мощность лазера 9,7 мВ 876543210 10 20 30 40 50 60 Время (сек) Рисунок 14. Зависимость флуоресценции KFP от мощности облучения синим лазером (405 нм) при pH 4,02. Регистрация флуоресценции на 519 нм.
Интенсивность флуоресценции Интенсивность флуоресценции Мощность лазера 90 мВ Мощность лазера 30 мВ Мощность лазера 9,7 мВ 322110 20 40 60 80 1Время (сек) Рисунок 15. Зависимость флуоресценции KFP от мощности облучения синим лазером (405 нм) при pH 4,02. Регистрация флуоресценции на 590 нм.
Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют о том, что: 1) при кислых значениях pH интенсивность флуоресценции KFP как на 520 нм, так и на 590 нм существенно возрастает по сравнению с нейтральным pH; 2) К росту флуоресценции на 520 нм приводит появление формы KFP с катионным хромофором, доля которой при нейтральных pH незначительна; 3) Главным отличием эффекта разгорания KFP при кислых значениях pH от эффекта разгорания KFP в щелочной области pH является отсутствие флуоресцирующих конформеров, восприимчивых к действию синего света.
3. Свойства белка KFP с заменой G148N Использование в качестве акцептора во FRET-паре нефлуоресцирующих хромобелков решает проблему перекрывания спектров флуоресценции донора и акцептора. Согласно литературным данным, введение мутации G148N в KFP позволяет сделать белок не флуоресцирующим и неразгорающимся, что позволяет путем минимальных изменений в структуре разработанного в нашей лаборатории FRETсенсора на каспазу-3 TagRFP-23-KFP наделить его указанным преимуществом.
3.1. Определение размеров хромопротеина KFP-G148N Размер белка KFP-G148N определяли с помощью гель-фильтрационной хроматографии (Рис. 16) и методом динамического светорассеяния (Рис. 17).
Целевой белок собирали по поглощению на 560 нм. На хроматограмме присутствует один пик, который соответствует, молекулярной массе около 63 кДа.
Интенсивность флуоресценции Рисунок 16. Гель-фильтрация KFP-G148N на носителе Superdex 200 10/300 GL.
Регистрация поглощения выполнялась на двух длинах волн - 280 и 560 нм.
В результате экспериментов по динамическому рассеянию было вычислено, что гидродинамический радиус белка KFP-G148N равен 3,5 нм, что в приближении сферической модели соответствует молекулярной массе, равной 61 кДа (рис. 17).
Рисунок 17. Размер частиц KFP-G148N по результатам экспериментов по динамическому светорассеянию.
Таким образом, поскольку рассчитанная молекулярная масса KFP-G148N составляет 25,9 кДа, выделенный образец хромопротеина представляет собой димер.
По данным ПААГ-электрофореза в элюате наблюдаются две основные полосы - и 9 кДа, в то время как в районе 26 кДа присутствует только следовое количество белка (Рис. 18). Поскольку при созревании KFP-G148N в полипептидной цепи образуется разрыв, при проведении денатурирующего электрофореза должны наблюдаться две полосы. Первая соответствует 170 аминокислотам с C-конца KFP-G148N (17 кДа), а вторая - 66 аминокислотам с N-конца KFP-G148N (молекулярная масса данного фрагмента около 9 кДа). Таким образом, данные денатурирующего электрофореза и анализ денситограммы показали, что выделенный образец содержит 85% созревшей формы KFP-G148N и в элюате находится чистый образец KFP-G148N.
Рисунок 18. Справа - ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия фракции KFP-G148N после гель-фильтрации.
Слева - денситограмма линейного участка, обозначенного желтой линией.
Результаты экспериментов по гель-фильтрации и динамическому светорассеянию KFP-G148N оказались неожиданными, поскольку в литературе такой замене приписывали только потерю свойства разгорания белка.
Тетрамер KFP представляет собой димер димеров, в которых мономеры ориентированы антипараллельно друг относительно друга. Каждый мономер взаимодействует с двумя другими мономерами в тетрамере, образуя два разных интерфейса - для связи мономеров в димер и связи димеров между собой. Поскольку замена G148N приводит к разрушению тетрамерной структуры при сохранении димерной, логично предположить, что эта мутация нарушает взаимодействия между димерами белка. Анализ кристаллической структуры тетрамера KFP показал, что аминокислота в 148 положении действительно попадает в область интерфейса димеров (Рис.19). Gly1при формировании тетрамера взаимодействует с остатками Phe198, Phe200 и Ile1(Рис. 20). Вероятно, существенно больший размер аспарагина по сравнению с глицином приводит к стерическим затруднениям во взаимодействии димеров, что препятствует формированию тетрамера.
Рисунок 19. Структура тетрамера KFP. Синим цветом выделен остаток глицина-148.
Рисунок 20. Интерфейс тетрамеризации KFP. Зеленым цветом выделен глицин-148, остатки Phe198, Phe200 и Ile151 представлены в виде поверхности, доступной растворителю.
3.2. Кинетики разгорания и тушения флуоресценции KFP-G148N Нами были получены кинетики разгорания под действием лазерного излучения с длиной волны 532 нм при pH 8,8. В качестве образца сравнения использовали KFP той же концентрации в том же буфере. Сравнение полученных результатов (Рис. 21) показывает, что замена глицина в 148 положении на аспарагин действительно делает KFP неразгорающимся.
Разгорание флуоресценции KFP Разгорание флуоресценции KFP, повтор через 10 минут Разгорание флуоресценции KFP-G148N Разгорание флуоресценции KFP-G148N, повтор через 10 минут 20100 10 20 30 40 50 60 Время (сек) Рисунок 21. Сравнение кинетик разгорания KFP и мутантного белка KFP-G148N в буфере 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,8. Возбуждение флуоресценции на 532 нм, регистрация - на 590 нм.
Интенсивность флуоресценции 3.3. Спектральные свойства белка KFP-G148N Нами были получены спектры образцов KFP и мутантного белка KFP-G148N, имеющих одинаковую оптическую плотность в максимуме поглощения (Рис. 22).
KFP KFP-G148N 0,0,0,400 500 600 7Длина волны, нм Рисунок 22. Спектры поглощения KFP и мутантного белка KFP-G148N в буфере mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM имидазол, pH 7,6.
Максимум поглощения мутантного белка KFP-G148N и исходного белка совпадают, однако спектр поглощения мутантного белка отличается от спектра KFP более выраженным плечом на 520 нм.
В спектрах флуоресценции наблюдается смещение максимума флуоресценции с 598 нм в случае KFP до 591 нм для мутантного белка, а также в 2,2 раза большая интенсивность флуоресценции последнего (Рис. 23).
KFP_G148N KFP 560 580 600 620 640 660 680 7Длина волны, нм Рисунок 23. Спектры флуоресценции KFP и мутантного белка KFP-G148N в буфере 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM имидазол, pH 7,6. Возбуждение флуоресценции на 5нм.
Поглощение Интенсивность флуоресценции При этом в отличие от исходного белка KFP спектры возбуждения и флуоресценции KFP-G148N демонстрируют наличие форм белка с нейтральным и катионным хромофором уже при нейтральных значениях pH (Рис. 24,25) KFP KFP-G148N 1,0,0,0,0,0,300 350 400 450 500 550 6Длина волны, нм Рисунок 24. Нормированные спектры возбуждения флуоресценции KFP и мутантного белка KFP-G148N в буфере 0.1М CH3COONa, 0.2 M CH3COONH4, pH 7,0.
Регистрация флуоресценции на 620 нм.
KFP, возбуждение флуоресценции на 455 нм KFP-G148N, возбуждение флуоресценции на 455 нм KFP, возбуждение флуоресценции на 530 нм KFP-G148N, возбуждение флуоресценции на 530 нм 1,0,0,0,0,0,500 550 600 650 700 7Длина волны, нм Рисунок 25. Нормированные спектры флуоресценции KFP и мутантного белка KFPG148N в буфере 0.1М CH3COONa, 0.2 M CH3COONH4, pH 7,0.
Что касается зависимости флуоресцентных свойств KFP-G148N от pH, то как и в случае KFP наблюдается рост флуоресценции белка при смещении как в кислую, так и в щелочную область pH, но при этом в отличие от исходного белка положения максимумов Нормированная флуоресценция Нормированная флуоресценция возбуждения и флуоресценции мутантного белка KFP-G148N изменяются в пределах нм (Рис. 26).
Положение максимума возбуждения флуоресценции Положение максимума флуоресценции 6 Флуоресценция на 590 нм 6 Флуоресценция на 520 нм 455355255155554 6 8 4 6 8 pH Рисунок 26. Зависимость флуоресцентных свойств белка KFP-G148N от pH.
4. Свойства сенсора FusionRed-Linker1-Dedushka Для обеспечения возможности одновременной детекции активности сразу двух ферментов нами был разработан сенсор на основе FRET-пары дальнекрасных белков FusionRed и Dedushka. Для изучения свойств данного сенсора в качестве линкера была использована последовательность LKDEVDGDEVDGAS, также распознаваемая каспазой3, но отличающаяся наличием двух повторов DEVD, что должно способствовать увеличению эффективности расщепления сенсора ферментом.
Экспрессия слитых генов флуоресцирующих белков FusionRed и Dedushka в клетках E. coli приводит к синтезу полноразмерного продукта с молекулярной массой 53,кДа.
4.1. Определение размеров сенсора FusionRed-Linker1-Dedushka Определение размера полученной конструкции проводили с помощью гельфильтрации и методом динамического светорассеяния. Результаты гель-фильтрации говорят о том, что субстрат FusionRed-Linker1-Dedushka в основном выходит в виде фракции, молекулярная масса которой составляет около 437 кДа, следовательно, так как масса цельной конструкции составляет 53,6 кДа, белок выходит в форме октамера (Рис.
27).
Интенсивность флуоресценции Длина волны максимума флуоресценции, нм Рисунок 27. Гель-фильтрация окрашенной фракции, полученной из лизата клеток осаждением сульфатом аммония и отдиализованной в течение ночи к буферу 20 мМ ТрисHCl, 150 мМ NaCl, рН 8,8. Регистрацию поглощения вели на 280 нм (синяя линия) и 560 нм (красная линия). Пунктирной линией обозначен момент введения образца.
Ре-хроматография фракции, соответствующей молекулярной массе 437 кДа, демонстрирует, что образец выходит в виде фракции, молекулярная масса которой составляет около 463 кДа, то есть преобладающим олигомерным состоянием FusionRedLinker1-Dedushka действительно является октамер (Рис. 28).
Рисунок 28. Ре-хроматография фракции FusionRed-Linker1-Dedushka, соответствующей молекулярной массе 437 кДа. Элюирующий буфер - ТрисHCl, 150 мМ NaCl, рН 8,8. Регистрацию поглощения вели на 280 нм (синяя линия) и 560 нм (красная линия). Пунктирной линией обозначен момент введения образца.
В результате экспериментов по динамическому светорассеянию было вычислено, что гидродинамический радиус белка FusionRed-Linker1-Dedushka равен 6,2 нм, что в приближении сферической модели соответствует молекулярной массе, равной 244 кДа, соответствующей тетрамерной форме белка (Рис. 29).
Рисунок 29. Размер частиц FusionRed-Linker1-Dedushka по результатам экспериментов по динамическому светорассеянию.
Таким образом, белок слияния FusionRed-Linker1-Dedushka представляет собой тетрамер, имеющий тенденцию к октамеризации при повышении концентрации (как в случае гель-фильтрации).
По данным ПААГ-электрофореза в элюате находится достаточно чистый образец FusionRed-Linker1-Dedushka. При этом наблюдаются две основные полосы - 55 и 46 кДа, в то время как в районе 26 кДа белковых фракций практически нет (Рис. 30). Поскольку при созревании FusionRed в полипептидной цепи образуется разрыв, наблюдаемые полосы можно сопоставить соответственно форме субстрата с несозревшим FusionRed (53,6 кДа) и с зрелым FusionRed, содержащим разрыв полипептидной цепи (46,3 кДа).
Рисунок 30. - ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия фракции FusionRed-Linker1-Dedushka после гель-фильтрации.
евая дорожка - маркеры молекулярной массы белка, кДа. Справа приведена денситограмма линейного участка, обозначенного желтой линией.
Таким образом, анализ денситограммы показал, что выделенный образец содержит 54% несозревшей и 46% созревшей формы FusionRed-Linker1-Dedushka, то есть FusionRed-Linker1-Dedushka экспрессируется в виде смеси созревшего и несозревшего белка, в котором отсутствует разрыв полипептидной цепи.
4.2. Определение эффективности переноса энергии FusionRed в конструкции FusionRed-Linker1-Dedushka Для оценки отношения квантовых выходов свободного FusionRed и FusionRed в конструкции FusionRed-Linker1-Dedushka было рассчитано относительное поглощение FusionRed в конструкции. В первую очередь было проведено разложение спектра поглощения FusionRed на два пика с помощью распределения Гаусса (Рис. 31).
0,0,0,0,0,0,0,0,0,-0,450 500 550 600 650 700 750 8Длина волны, нм Рисунок 31. Разложение спектра поглощения FusionRed на Гауссовы полосы.
Были определены положения и полуширины пиков и в дальнейшем данные значения были использованы при разложении спектра поглощения конструкции (Рис. 32).
Спектр поглощения FusionRed-Linker1-Dedushka был разложен с помощью четырёх гауссианов. При этом две компоненты относятся к FusionRed, а другие две - к Dedushka.
0,0,0,0,0,0,0,0,0,450 500 550 600 6Длина волны, нм Рисунок 32. Разложение спектра поглощения конструкции FusionRed-Linker1Dedushka на Гауссовы полосы.
Поглощение Поглощение Далее проводилось вычисление вклада FusionRed в суммарную оптическую плотность конструкции FusionRed-Linker1-Dedushka на длине волны возбуждения флуоресценции. Для этого суммировались оптические плотности каждой из двух компонент FusionRed на длине волны 530 нм (DFusionRed530). Вычислив площадь под спектром эмиссии флуоресценции FusionRed-Linker1-Dedushka (Sem) при возбуждении светом 530 нм, можно найти отношение Sem/DFusionRed530. Вычисляя такое же отношение для индивидуального FusionRed (S/D), было найдено отношение квантовых выходов FusionRed в составе конструкции и в виде индивидуального белка: n = (Sem/DFusionRed530)/(S/D) = 76%, т.е. в полученной конструкции происходит индуктивнорезонансный перенос энергии, эффективность которого составляет E = 100% - 76% = 24%.
4.3. Спектральные свойства выделенной конструкции Снижение интенсивности флуоресценции полученного белка слияния FusionRedLinker1-Dedushka на длине волны эмиссии FusionRed по сравнению с индивидуальным FusionRed на 22% свидетельствует о наличии переноса энергии между донором и акцептором и хорошо соотносится с рассчитанным значением эффективности переноса энергии, равным 24% (Рис. 33).
FusionRed FusionRed-Linker1-Dedushka 4332211550 600 650 700 750 8Длина волны, нм Рисунок 33. Спектры флуоресценции индивидуального FusionRed (черная линия) и белка слияния FusionRed-Linker1-Dedushka (красная линия). Возбуждение флуоресценции на 530 нм.
Нормированные спектры флуоресценции индивидуального FusionRed и белка слияния FusionRed-Linker1-Dedushka демонстрируют сдвиг максимума последнего в сторону больших длин волн, что также свидетельствует о наличии переноса энергии в конструкции (Рис. 34).
Интенсивность флуоресценции Рисунок 34. Нормированные спектры флуоресценции индивидуального FusionRed (черная линия) и белка слияния FusionRed-Linker1-Dedushka (красная линия).
Возбуждение флуоресценции на 530 нм.
4.4. Определение эффективности расщепления конструкции FusionRed-Linker1-Dedushka под действием каспазы-Для оценки эффективности расщепления конструкции под действием каспазы-было проведено измерение спектров флуоресценции до добавления фермента и после инкубации с ним. Белок слияния инкубировался с каспазой-3 в течение 24 часов при температуре 15С. В результате инкубации с каспазой-3 наблюдается увеличение интенсивности флуоресценции образца сенсора FusionRed-Linker1-Dedushka на 30%, что хорошо согласуется с данными об эффективности переноса энергии в конструкции (Рис.
35).
Рисунок 35. Спектр флуоресценции конструкции FusionRed-Linker1-Dedushka до (чёрная линия) и после (синяя линия) обработки каспазой-3. Возбуждение флуоресценции на 530 нм. Буфер 50 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.1% CHAPS, mM DTT, 0.1 mM ЭДTA, 10% глицерин.
Для подтверждения эффективного расщепления линкера под действием каспазы-был также проведён электрофорез исходных образцов FusionRed-Linker1-Dedushka и после обработки каспазой-3 (рис. 36).
Рисунок 36. ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия, 4-15% полиакриламидный гель. Перед нанесением образцы прогревались в течение 5 мин. на кипящей водяной бане. 1 - маркеры молекулярной массы белка, кДа; 2 - исходный белок, 3 - конструкция, обработанная каспазой-3.
В исходной конструкции наблюдаются две основные полосы - 57 и 47,5 кДа.
Первая соответствует конструкции FusionRed-Linker1-Dedushka с несозревшей формой FusionRed, а вторая зрелой конструкции. После инкубации с каспазой-3 полоса 47,5 кДа исчезает, но появляется полоса в районе 28 кДа (Dedushka с участком линкера) и 20 кДа (фрагмент FusionRed), что говорит об эффективном расщеплении линкера (см. Таблицу 1).
Масса, кДа Фрагменты субстрата с Фрагменты после расщепления учетом разрыва ПП цепи 1-й DEVD 2-й DEVD Оба DEVD 46,26,26,3 26,7,19,20 19,7,7,2 7,0,Таблица 1. Рассчитанные массы компонентов субстрата FusionRed-Linker1Dedushka до и после расщепления линкера.
Таким образом, конструкция FusionRed-Linker1-Dedushka эффективно расщепляется под действием каспазы-3.
5. ВЫВОДЫ 1. Продемонстрирована возможность детекции активности каспазы-3 с помощью сенсора TagRFP-23-KFP в клетках меланомы мыши B16, обладающих сильной пигментацией; по изменению времени жизни флуоресценции TagRFP.
2. Обнаружено появление в кислой области pH новых спектральных форм KFP; первая из них характеризуется поглощением на 450 нм и может быть идентифицирована как фракция с нейтральной формой хромофора, вторая флуоресцирует на 530 нм и ее появление на основании данных по кинетическому изотопному эффекту в дейтерированной воде может быть объяснено образованием катионной формы хромофора в результате переноса протона в возбужденном состоянии.
3. Продемонстрировано, что при нейтральном значении pH мутантный белок KFPG148N обладает в 2,2 раза более яркой флуоресценцией, чем исходный белок; в отличие от KFP спектры флуоресценции мутантного белка KFP-G148N демонстрируют наличие фракций с нейтральным и катионным хромофором при нейтральных значениях pH.
4. Показано, что замена G148N приводит к изменению олигомерного состояния KFP с тетрамера на димер.
5. На основании изучения свойств сенсора каспазы-3 на основе белков FusionRed и Dedushka: показано, что он представляет собой тетрамер, в котором эффективность индуктивно-резонансного переноса энергии от FusionRed к Dedushka составляет 24%.
Показано расщепление субстрата на основе белков FusionRed и Dedushka каспазой-in vitro по изменению параметров флуоресценции и электрофоретическим методом.
СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи 1. Rusanov A.L., Mironov V.A., Goryashenko A.S., Grigorenko B.L., Nemukhin A.V., Savitsky A.P. Conformational partitioning in pH-induced fluorescence of the kindling fluorescent protein (KFP) // J Phys Chem B. (2011);115(29):9195-201.
2. Rusanov A.L., Ivashina T.V., Vinokurov L.M., Goryashenko A.S., Zherdeva V.V., Savitsky A.P., FRET-sensor for imaging with lifetime resolution // Laser Applications in Life Sciences, edited by Matti Kinnunen; Risto Myllyl. Proceedings of the SPIE, Volume 7376, pp. 737611-1-6 (2010).
3. Лапшин Г.Д., Горященко А.C., Хренова М.Г, Русанов А.Л, Ивашина Т.В, Жердева В.В., Савицкий А.П. Оптимизация длины линкера в генетически кодируемых сенсорах каспазы-3 // Современные проблемы науки и образования (2011),-№6, (приложение "Биологические науки"), стр. Тезисы 1. А.С. Горященко, А.П. Савицкий Создание генетически кодируемого субстрата для in vivo определения активности каспазы-3 // Школа-конференция Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины 16-17 сентября 2010, Москва.
2. Горященко А.С., Жердева В.В., Щербо Д.С., Чудаков Д.М., Савицкий А.П.
Генетически-кодируемый FRET-субстрат каспазы-3 на основе дальнекрасных флуоресцирующих белков // Сборник статей третьей международной научнопрактической конференции Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине 26-28 апреля 2012, Санкт-Петербург.
3. Goryashchenko A.S., Zherdeva V.V., Shcherbo D.S., Chudakov D.M., Savitsky A.P. Farred fret-sensor for determination of caspase-3 activity // Материалы конференции Programmed Cell Death in Biology and Medicine 21-22 июня 2012,Москва.
4. Горященко А.С., Хренова М.Г., Ивашина Т.В., Савицкий А.П. Физико-химические и флуоресцентные свойства белка KFP с заменой G148N // Материалы IV Съезда биофизиков России, Симпозиум IIIФизика - медицине и экологии, 20 - 26 августа 2012 года г. Нижний Новгород, стр.55.
5. Goryashchenko A,S., Rusanov A.L., Mironov V.A., Nemukhin A.V., Savitsky A.P.
Fluorescent properties of the kindling fluorescent protein (KFP) at acidic pH values // 20th International Conference on Advanced Laser Technologies ALTТ12, 2 - 6 September 2012, Thun, Switzerland, pp. 369-370.
6. Alexander P. Savitsky, V.V. Zherdeva, I.G. Meerovich,M.G. Khrenova, A.S.
Goryashchenko,лFluorescence molecular bioimaging in drug design and screening // Russian-Chinese Workshop on Biophotonics and Biomedical Optics, September 26-28, 2012, Saratov, Russia, p.17.