На правах рукописи

ГОЛЫШЕВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ УДК 576.311.347: 612.176 СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАЕНИЗАЦИЯ РЕПЛИЦИРУЮЩЕГОСЯ ХРОМАТИНА 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006 2

Работа выполнена в отделе электронной микроскопии Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московского Государственного Университета им. М.В.

омоносова

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАЕН Поляков Владимир Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Коломиец Оксана Леонидовна доктор биологических наук Ляпунова Наталия Алексеевна

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта Российской академии наук

Защита состоится л21 ноября 2006 г. в часов _минут на заседании Диссертационного Совета Д.501.001.52 при Московском Государственном Университете им.

М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва Ленинские горы, д. 1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд..

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан л_2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Калистратова Е.Н.

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Растущий объем сведений о биохимических механизмах, осуществляющих внутриклеточные процессы, делает все более актуальным вопрос об их регуляции и координации. Очевидно, что разграничение внутриклеточного пространства на структурные и функциональные компартменты является важнейшим механизмом, обеспечивающим правильное функционирование клетки на всех уровнях ее организации.

Ядро клетки - яркий образец реализации этого принципа. В настоящее время не вызывает сомнений утверждение о том, что ядро представляет собой высокоупорядоченную систему. Однако, метаболические реакции, в которые напрямую вовлечен хроматин, до настоящего времени изучены в недостаточной степени, что связано с отсутствием последовательной модели, описывающей связь конформации ДНП-комплексов с их функционированием.

Основные затруднения при исследовании организации хроматина связаны с высокой плотностью упаковки ДНП-материала, лабильностью его структуры и отсутствием универсальных маркеров, позволяющих отслеживать динамику преобразований конкретных структур.

Репликация ДНК представляет особый интерес в связи с центральной ролью этого процесса в клетке. Механизмы и динамика репликации хорошо изучены на уровне целого ядра и на уровне белковых комплексов, осуществляющих синтез ДНК. Однако поведение нативного субстрата репликационных комплексов - хроматина - в ходе репликации, изучено фрагментарно.

Особый интерес представляют ультраструктурная организация репликационных сайтов - зон непосредственной активности факторов репликации. Немаловажными являются вопросы о конформации ДНК в этих зонах, о пространственной структуре мультиферментых комплексов, вовлеченных в синтез дочерних цепей ДНК, а так же о влиянии репликационных событий на общую организацию хроматина.

Цель данной работы состоит в том, чтобы, используя методы, позволяющие стабилизировать и выявлять нативные макромолекулярные комплексы хроматина, изучить положение реплицируемого хроматина в иерархии структурных уровней организации генома и предложить динамическую модель организации репликационных сайтов.

Задачи работы:

1) Изучить структуру реплицирующегося хроматина и репликационных сайтов в условиях, изменяющих характер компактизации хроматина, а также в условиях исчерпывающей экстракции гистонов.

2) Визуализировать макромолекулярные комплексы эу- и гетерохроматина, завершившего репликацию, используя длительное введение предшественников синтеза ДНК.

3) На ультраструктурном уровне провести сравнительный анализ методов визуализации репликационных сайтов.

4) Визуализировать репликационные сайты и макромолекулярные комплексы эухроматина, факультативного и конститутивного гетерохроматина при репликации ДНК на ультраструктурном уровне.

5) На модели преждевременно конденсированных хромосом изучить действие индукторов компактизации на реплицирующийся хроматин.

6) Изучить динамику структурных изменений реплицирующегося хроматина в преждевременно конденсированных хромосомах.

Научная новизна и практическое значение работы. В работе получены новые данные относительно структурной организации и физико-химических свойств тотального и реплицируемого хроматина. Впервые показано, что реплицируемый хроматин находится в менее компактном состоянии, и, в отличие от тотального хроматина, не компетентен к формированию структур высшего порядка - хромомеров и хромонемных комплексов.

Впервые показана хромонемная организация гетерохроматических блоков (хромоцентров) в ядрах клеток мыши. Изучены преобразования структуры хромоцентров при репликации слагающей их ДНК.

Полученные данные позволяют обобщить результаты светомикроскопических, биохимических и ультраструктурных исследований организации сайтов репликации ДНК. На основании результатов работы предложена модель организации репликационных сайтов в контексте высших уровней организации генома, учитывающая структурные и функциональные особенности реплицируемого хроматина.

Предлагаемая в работе совокупность методических подходов к изучению ультраструктуры хроматина может применяться для решения исследовательских задач, сопряженных с необходимостью дискриминации различных доменов хроматина по структурным особенностям и репликационному статусу.

Полученные данные также могут быть использованы в лекционных курсах, предназначенных для студентов и аспирантов, специализирующихся в области клеточной и молекулярной биологии.

Апробация работы. Основные результаты работы были изложены на заседании кафедры Клеточной биологии и гистологии Биологического факультета МГУ и на Московском семинаре по клеточной биологии под руководством Ю.С. Ченцова.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Список сокращений. БСА - бычий сывороточный альбумин, БрдУ - 5Т-бромдезоксиуридин, ГА - глютаровый альдегид, ПЭГ - полиэтиленгликоль, РС - репликационный сайт; ТЭА - триэтаноламин.

Материалы и Методы.

В качестве экспериментальных моделей использовали культивируемые in vitro клетки линий СПЭВ и L929 (Коллекция клеточных культур позвоночных института Цитологии РАН, Санкт-Петербург).

1. Выявление сайтов репликации и новореплицированной ДНК. В зависимости от задач экспериментов БрдУ (Sigma, США) вносили в среду культивирования в концентрации от 30 (для иммунофлуоресцентного исследования) до 50 мкМ (для иммуноэлектронной микроскопии) на 15-минут (пульс-мечение), 180 минут (длительное мечение) и 15 минут с последующим удалением БрдУ и инкубацией в свежей среде культивирования в течение 180 минут (отложенное мечение).

Клетки фиксировали свежеприготовленным 3,7 % нейтральным раствором параформальдегида (Sigma) на буфере PBS при температуре +37 С в течение 20 минут и обрабатывали 0,5 % раствором Triton-X100 на PBS в течение минут. Раствор Triton X-100 отмывали тремя сменами PBS в течение 15 минут.

Гидролиз ДНК проводили, обрабатывая клетки 4-х нормальной соляной кислотой 20 минут при комнатной температуре. Клетки тщательно отмывали в PBS и переносили в 1 % раствор БСА (Sigma) на PBS на 1 час.

Антитела против БрдУ (Sigma, клон BU-33, титр 1:100) и антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с FITC или Техасским красным (Sigma, титр 1:200), готовили на PBS с добавлением 0,05 % Tween-20.

Инкубацию с антителами против БрдУ проводили в течение 60 минут при температуре +37 С, инкубацию со вторыми антителами проводили при +4 С в течение 12 часов. Для выявления тотальной ДНК клетки докрашивали флюорохромом DAPI (4',6-диамино-2-фенилиндол) в концентрации 0,1 мкг/мл на PBS (10 минут при комнатной температуре). Препараты заключали в MOVIOL (Calbiochem) или в 50 % раствор глицерина на PBS с добавлением DABCO (1,4-диазабицикло[2.2.2]октан) (Sigma, 50 мг/мл).

2. Индукция преждевременной конденсации хроматина. Клетки, высаженные на покровные стекла или чашки Петри с адгезивным покрытием (Costar), культивировали до достижения конфлюэнтного монослоя. Перед слиянием клетки обрабатывали нокодазолом (Sigma, США) в концентрации мкг/мл в течение 120 минут. Все этапы процедуры осуществляли при температуре +37 С. Для инициации слияния клетки линии СПЭВ тщательно промывали в трех сменах PBS и обрабатывали 50 % (по массе) раствором ПЭГ1500 (Merck) на ССРХ с добавлением 15 % ДМСО (по объему) в течение секунд, затем тщательно отмывали ПЭГ и ДМСО, и переносили клетки в свежую среду культивирования. Полученные гибридные клетки фиксировали спустя 45 минут после инициации слияния.

3. Получение хромосомных препаратов. Для получения распластанных хромосомных препаратов использовали стандартную процедуру (Seabright, 1972). Для получения хромосомных препаратов in situ действовали согласно методике, изложенной в книге Брэдбери и др. (Москва, Мир, 1992).

4. Пермеабилизация клеток в растворах с низкой ионной силой. В зависимости от задач эксперимента для пермеабилизации использовали следующие растворы: 1) 20 ммоль ТЭА, 4 ммоль хлорида магния; 2) 20 ммоль ТЭА; 3) 2 ммоль ТРИС, 3 ммоль хлорида кальция. рН всех растворов - 7,4.

Клетки обрабатывали 1% раствором Triton X-100 на одном из вышеприведенных буферов в течение 1 минуты и фиксировали, перенося в 3,% раствор формальдегида или 1% ГА на том же буфере на 20 минут или минут соответственно.

Для дифференциальной деконденсации клетки, пермеабилизированные на буфере 2 ммоль ТРИС 3 ммоль CaCl2, переносили в раствор 2 ммоль ТРИС 0,ммоль CaCl2 и инкубировали в нем до визуально выявляемой дисперсии митотических хромосом и деконденсации материала ядрышек интерфазных клеток (~60-90 секунд), после чего клетки фиксировали, перенося в раствор фиксатора на декоденсирующем буфере.

5. Получение препаратов стабилизированного ядерного матрикса.

Клетки, выращенные на покровных стеклах, пермеабилизировали в течение минут 1 % Тритоном Х-100, приготовленным на растворе, содержащем ммоль ТРИС-HCl (pH 7,5), 5 ммоль MgCl2, 1 ммоль CuSO4, 1 ммоль PMSF.

Затем промывали тем же раствором без Тритона Х-100 в течение одной минуты и переносили в 2М раствор NaCl на 20 ммоль TRIS с добавлением 10 ммоль ЭДТА на 6 минут. Клетки фиксировали добавлением раствора формальдегида до финального содержания 3 %. Зафиксированные препараты ядерного матрикса тщательно отмывали дистиллированной водой для удаления хлорида натрия, после чего проводили процедуру выявления БрдУ.

6. Изучение препаратов и регистрация результатов. Полученные препараты изучали и фотографировали на оптическом микроскопе Carl Zeiss Axiovert 200M, оборудованном объективом Plan-Neofluar 100x 1,3 и цифровой камерой AxioCam HRm (1300х1030, 14 бит), управляемом программным комплексом AxioVision v3.4. Также использовали конфокальный лазерный сканирующий микроскоп LSM 510 (Carl Zeiss), оснащенный аналогичным объективом. Полученные изображения обрабатывали в программах ImageJ v1.49x и Adobe Photoshop v5.0 LE (Adobe Inc, США). Для первичной обработки данных, получаемых с конфокального микроскопа, использовали программу AIM Confocal Image Browser (Carl Zeiss, Германия). Трехмерную деконволюцию серий оптических срезов осуществляли по алгоритму Constraned Iterative Filter с помощью соответствующего модуля из комплекта поставки демонстрационной версии программы AxioVision v3.1 (Carl Zeiss, Германия).

7. Электронная микроскопия. Клетки маркировали антителами, конъюгированными с Nano-gold, согласно процедуре, изложенной выше, дополнительно фиксировали 1 % ГА на PBS, после чего обрабатывали согласно протоколу серебряного усиления (Dancher, 1981). Клетки заключали в Эпон по процедуре, включающей обезвоживание в серии спиртов повышающейся концентрации, обезвоживание ацетоном, пропитку в трех сменах смеси эпонацетон с повышающейся долей эпона и полимеризацию смолы при 60С.

Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Reichert Jung Ultracut E с использованием стеклянных ножей.

Для выявления реплицированной ДНК на ультратонких срезах свежеприготовленные срезы неокрашенных клеток на никелевых сетках, покрытых формваровой подложкой, обрабатывали в течение 10 минут 10 % раствором пероксида водорода, тщательно отмывали в PBS, и переносили в 5 % раствор БСА на PBS. Антитела против БрдУ в разведении использовали в разведении 1:75 - 1:50 на PBS с добавлением 0,1 % БСА. Инкубацию с антителами проводили в течение 12 часов при +4 С. Далее срезы отмывали, и на 60 минут помещали в капли суспензии коллоидных золотых частиц диаметром 15 нм с адсорбированными на них антителами против иммуноглобулинов мыши (1:100 на 0,1 % растворе БСА в PBS). Инкубацию проводили при комнатной температуре во влажной камере. По завершении инкубации срезы промывали PBS и дистиллированной водой.

Далее срезы дополнительно контрастировали 2 % водным раствором УА (20 минут) и раствором цитрата свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963). В качестве отрицательного контроля на чистоту связывания антител использовали немеченые клетки, имеющиеся на каждом из изученных срезов.

Изучали и фотографировали полученные препараты на электронных микроскопах Hitachi HU-11В и HU-12B (Япония). Негативы сканировали в монохромном режиме с разрешением 1200 точек на дюйм и глубиной представления цвета 16 бит. Использовали слайд-сканнер Duoscan T(Agfa). Сканированные изображения монтировали в программе Adobe Photoshop v5.0 LE. При измерениях структур в качестве внутреннего стандарта размеров использовали частицы коллоидного золота, конъюгированные с антителами. Их размер составляет 151 нм.

Результаты и их обсуждение.