На правах рукописи

БОЦИНА Александра Юрьевна

РОЛЬ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНА ИНДУЦИБЕЛЬНОЙ

NO-СИНТАЗЫ В ФОРМИРОВАНИИ ИНФАРКТА МОЗГА

У БОЛЬНЫХ С КАРОТИДНЫМ ИШЕМИЧЕСКИМ АТЕРОТРОМБОТИЧЕСКИМ ИНСУЛЬТОМ

14.00.13 - Нервные болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2009

Работа выполнена в ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Научный руководитель:

Член-корреспондент РАМН, профессор Вероника Игоревна Скворцова

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Алла Борисовна Гехт

Доктор медицинских наук, профессор Марина Юрьевна Максимова

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Защита состоится л15 мая 2009 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.09 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РМГУ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1.

Автореферат разослан л13 мая 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

профессор Л.В.Губский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение

Сосудистые заболевания головного мозга и, в частности, ишемический инсульт - одна из наиболее важных и актуальных медицинских проблем нашего общества. Широкое распространение инсульта, высокий процент смертности и тяжелой инвалидизации определяют приоритетность исследований в области изучения патогенеза развития этого заболевания.

В настоящее время в изучении генетической предрасположенности инсульта, равно как и других мультифакторных заболеваний, используется анализ генетических ассоциаций, с помощью которого проводится изучение кандидатных генов, участвующих в формировании основных факторов риска сосудистой патологии. В последние несколько лет анализ генетических ассоциаций используется и для изучения аспектов индивидуальной чувствительности мозга к ишемическому повреждению и возможному прогнозированию течения и исхода заболевания.

Избыточная продукция оксида азота (NO) при обязательном участии фермента индуцибельной NO-синтазы (iNOS) с последующим образованием токсического соединения пероксинитританиона (ONOO-) в настоящее время рассматривается как один из важнейших пусковых механизмов гибели клеток пенумбры в рамках нейроиммунного ответа. К основным нейротоксическим эффектам ONOO- относят выработку провоспалительных цитокинов, инактивацию ферментов антиоксидантной защиты, участие в окислении белков, что приводит к повреждению и дисфункции клеток, а также фрагментации ДНК [Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001]. Особое внимание привлекает факт относительно поздней экспрессии iNOS на этапе доформирования очага инфаркта [Samdani A.F. и соавт., 1997; Niwa M. И соавт., 2001], что в дальнейшем возможно определит избирательное применение селективных ингибиторов фермента в условиях стационаров. Участие гена NOS2, кодирующего синтез фермента iNOS, в формировании очага инфаркта мозга было многократно продемонстрировано на различных моделях экспериментальной ишемии с применением нокаутных животных [Iadecola C. и соавт., 1997; Loihl A.K. и соавт., 1999].

В связи с изложенным выше, представляет несомненный интерес проведение анализа структурных особенностей гена NOS2 и оценка их роли в формировании инфаркта мозга у больных с ишемическим инсультом в остром периоде.

Цель исследования

Изучение роли полиморфных вариантов гена индуцибельной NO-синтазы (NOS2) в формировании инфаркта мозга, течении и исходе заболевания у больных с каротидным ишемическим атеротромботическим инсультом.

Задачи исследования

1. Изучить клинические особенности развития каротидного ишемического атеротромботического инсульта и закономерности динамики формирования инфаркта мозга в остром периоде заболевания.

2. Проанализировать полиморфные варианты Ц2447C/G, -1659C/T, -0,7 (Т)n I/D и Ser608Leu(150C/T) гена NOS2 и их влияние на динамику формирования инфаркта мозга.

3. Оценить связь анализируемых полиморфных вариантов гена NOS2 с течением и исходом ишемического инсульта.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное динамическое клиническое, МР-морфометрическое и молекулярно-генетическое исследование пациентов в остром периоде ишемического инсульта с целью изучения роли полиморфных вариантов Ц2447C/G, -1659C/T, -0,7 (Т)n I/D и Ser608Leu(150C/T) гена NOS2 в динамике формирования инфаркта мозга, течении и исходе заболевания.

Обнаружены статистически значимые ассоциации полиморфизмов Ser608Leu(C/T) и -1659C/T гена NOS2 c динамикой формирования очага инфаркта мозга, что косвенно может свидетельствовать о функциональной значимости вышеуказанных полиморфных вариантов.

Выявлено достоверное преобладание носителей гомозиготного С/C генотипа по полиморфизму Ser608Leu(C/T) гена NOS2 среди больных с отрицательной динамикой в неврологическом статусе в период с 1-х по 3-и сутки и в группах больных с умеренной и тяжелой инвалидизацией, по сравнению с носительством аллеля Т, независимо от исходного объема инфаркта мозга.

Практическая значимость работы

1. Полученная взаимосвязь полиморфизма Ser608Leu(C/T) гена NOS2 c динамикой формирования очагов инфаркта мозга, течением и исходом ишемического инсульта позволит применять анализ генотипов Ser608Leu(C/T) в качестве критерия прогнозирования течения и исхода заболевания.

2. Выявление генетических маркеров индивидуальной чувствительности мозга к ишемии расширяет возможности индивидуализированной профилактики ишемического инсульта и позволяет разработать новые подходы к диспансеризации здоровых лиц из группы риска.

3. Изучение генетических основ повреждающего действия ишемии позволяет выявить новые мишени для лечения инсульта. Ассоциация полиморфного варианта Ser608Leu(C/T) гена NOS2 с динамикой формирования инфаркта мозга показывает перспективность использования нейропротекторов, реализующих свое действие через высокоселективное ингибирование фермента iNOS.

Положения, выносимые на защиту

1. Формирование объема инфаркта мозга, динамика неврологического статуса и степень функционального восстановления при ишемическом инсульте статистически значимо ассоциированы с полиморфным вариантом Ser608Leu(C/Т) 16-го экзона гена NOS2, что косвенно свидетельствует о функциональной значимости данного участка, определяющего замену аминокислоты серина на лейцин в последовательности первичной структуры белка фермента iNOS.
2. Высокодостоверное различие в относительной динамике объема исходно малых очагов инфаркта мозга у носителей С/С генотипа в сравнении с носителями аллеля Т по Ser608Leu(C/Т) гена NOS2, позволяет предположить различную степень значимости избыточного синтеза NO для формирования очагов разного объема.
3. Обнаруженная связь полиморфизма гена NOS2, кодирующего синтез iNOS, с динамикой формирования инфаркта мозга, подтверждает участие важнейших медиаторов нейроиммунного ответа NO и ONOO- в ишемическом повреждении головного мозга у больных с каротидным ишемическим атеротромботическим инсультом и обосновывает изучение и необходимость разработки нейропротекторов, реализующих свое действие путем высокоселективного ингибирования фермента iNOS.

Внедрение результатов исследования

Результаты настоящего исследования применяются в работе неврологических отделений ГКБ №20 и №31 г.Москвы.

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на совместной конференции кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии медико-биологического факультета ГОУ ВПО Российского государственного медицинского университета Росздрава и отдела молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН (протокол №7 от 12 декабря 2008 года).

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 3 в центральной отечественной печати и 3 - в зарубежной.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, включает 16 рисунков, 10 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания применяемых методов, 2 глав собственных результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы состоит их 113 источников, включая 13 отечественных и 100 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Общая характеристика больных и методы исследования

В основу работы положены результаты исследования 80 пациентов (славян из Московской популяции) с острым каротидным ишемическим атеротромботическим инсультом, поступивших в неврологические клиники РГМУ (ГКБ № 20 и ГКБ № 31 г. Москвы) за период 2002 - 2005 гг., соответствовавших критериям включения в исследование.

В исследование были включены 54 женщины и 26 мужчин в возрасте от 47 до 89 лет (средний возраст 69,8+1,14). Все пациенты получали унифицированную базисную терапию, реперфузионную и нейропротективную терапию.

Из исследования исключались больные с перенесенными ранее инсультами, острыми заболеваниями воспалительной и невоспалительной природы, острым инфарктом миокарда, сердечной, печеночной и почечной недостаточностью, эндокринными и аутоиммунными заболеваниями и другими состояниями, сопровождающимися нарушениями системной гемодинамики и метаболизма, а также пациенты с онкологической патологией.

В качестве сравнения использовалась группа славян из Московской популяции в количестве 50 человек, сравнимых по полу и возрасту с основной группой не, без инсультов в анамнезе и согласно данным нейровизуализации (КТ/МРТ головного мозга). Все данные о группе сравнения, включая образцы ДНК, были предоставлены Отделом Молекулярных Основ Генетики Человека ИМГ РАН.

Методы исследования

1. Клинико-инструментальные методы

Для стандартизации обработки клинического материала и проведения статистического анализа тяжесть состояния больных с ишемическим инсультом и выраженность у них неврологического дефицита оценивали по балльным шкалам Оргогозо [Orgogozo J.M., 1986] и NIHSS [Brott T.G. и соавт., 1989] на 1-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки от развития ишемического инсульта. Группировка пациентов в зависимости от динамики тяжести состояния определялась по шкале Оргогозо. Динамика оценивалась как положительная в случае прибавления минимум пяти баллов по шкале в течение анализируемого периода наблюдения, и как отрицательная в случае уменьшения минимум на пять баллов по шкале. Состоянием без динамики считалось отсутствие прироста или уменьшения баллов по шкале Оргогозо в течение анализируемого периода. Степень функционального восстановления утраченных оценивалась по индексу Бартел [Barthel D., 1965] на 21-е сутки инсульта.

Ишемический характер инсульта был установлен по данным анамнеза и клинической картины заболевания, данных МРТ-исследования головного мозга. Патогенетический характер инсульта устанавливался в соответствии с критериями TOAST, на основании данных анамнеза и особенностей клинической картины заболевания, данных ультразвуковой допплерографии (УЗДГ) и дуплексного сканирования (ДС) магистральных артерий головы (МАГ), ЭКГ и ЭХО-КГ.

Для оценки изменения объема ишемического повреждения головного мозга всем пациентам проводилась магнитно-резонансная томография (МРТ) головного мозга и МР-морфометрия на 1-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки от развития инсульта. Исследования выполняли на магнитно-резонансном томографе " Эллипс" ТМП-150, с индукцией магнитного поля 0,15 Тесла (научно-производственная фирма "АЗ", Россия). Морфометрическую обработку полученных изображений выполняли с применением программных пакетов "OSIRIS" и "TOMOSOFT-Net"- комплекса прикладных программ томографа "Эллипс", который включает набор последовательностей сканирования, а также среду для редактирования и анализа получаемых изображений.

2. Молекулярно-генетическое исследование

Молекулярно-генетическое исследование проводилось на базе Отдела Молекулярных Основ Генетики Человека ИМГ РАН. При проведении генетического анализа экстракцию геномной ДНК производили из лейкоцитов свежей незамороженной венозной крови по стандартной методике (9,0 мл крови с добавлением 1,0 мл ЭДТА) с применением экстракции смесью фенол/хлороформ. Прямая ДНК-диагностика полиморфных участков промотерной области Ц2447C/G, -1659C/T, -0,7 (Т)n I/D и Ser608Leu(C/T) 16-го экзона гена NOS2 производилась путем амплификации в ПЦР участков с последующей их обработкой эндонуклеазами рестрикции и электрофорезом в полиакриламидном геле.

Выбор полиморфизмов гена NOS2 для анализа их роли в формировании инфаркта мозга определялся прежде всего частотой распределения минорных аллелей в популяции. На основании опубликованных данных по частоте распределения минорных аллелей полиморфных вариантов гена NOS2 в близкородственных европейских популяциях нами были выбраны для изучения вышеуказанные участки гена. Распределение аллельных вариантов изучаемых полиморфизмов соответствовало закону Харди-Вайнберга. Анализ полиморфизма гена NOS2 в группе сравнения показал, что выбранные участки гена отличаются достаточно высокими частотами распределения минорных аллелей.

3. Статистический анализ