На правах рукописи

БИЧЕРОВА ИРИНА АНАТОЛЬЕВНА

ОРГАНИЗАЦИЯ ФОЛЛИКУЛОВ И

ПАРАФОЛЛИКУЛЯРНЫХ РЕГИОНОВ ЯИЧНИКОВ

НА ЭТАПАХ ИХ ПОЗИТИВНОГО И АТРЕТИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ

(ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ)

03.00.25 Ц гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва 2008

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Научный руководитель:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Волкова Ольга Васильевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Дубовая Татьяна Клеониковна

ГОУ ВПО РГМУ Росздрава

доктор медицинских наук, профессор Ерофеева Людмила Михайловна

ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава

Ведущее учреждение:

Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова.

Защита состоится л8 декабря 2008 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.04. при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1).

Автореферат разослан л27 октября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор А.И.Щеголев

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время актуальность проблемы овофолликулогенеза обусловлена высокой частотой заболеваний яичников, связанных с нарушениями процесса их развития, возникновением в репродуктивном периоде дисфункциональных состояний, возможностью бесплодия (Amsterdam A., Sasson R., 2002; Г.Т.Сухих и др. 2006 и многие другие). Накопленные данные позволяют сделать заключение, что женские половые железы относятся к наиболее динамичным системам организма, характеризующимся не только сложностью происходящих в них морфогенетических преобразований (для развивающихся фолликулов характерен целый комплекс тканей с высокой динамикой развития за очень короткий период времени), но и сложностью и многообразием механизмов регуляции их функции.

Установлено, что система регуляции фолликулогенеза представлена сложным иерархическим комплексом, включающим гипоталамо- гипофизарный и гонадный уровни. Кроме того, в регуляции развития яичников и фолликулогенеза принимают участие гормоны периферических эндокринных желез (щитовидной, надпочечников) (Алкадарская И.М. 1980; Миловидова Н.С. 1987; Волкова О.В., Боровая Т.Г. 1998). Нарушение физиологического баланса гормонов и других биологически активных веществ в рассматриваемой системе неблагоприятно влияет на органогенез и гистофизиологию яичников на последовательных этапах развития.

Однако, полученные данные свидетельствуют о том, что именно внутрияичниковым, внутрифолликулярным механизмам принадлежит ключевая роль в физиологическом течении фолликулогенеза, ибо они опосредуют и модулируют действие центральных и многих других механизмов регуляции (Волкова О.В. 1986; Бурлеев В.А. и др. 1998; О.В.Волкова, Т.Г.Боровая 1999; Adashi A. et al. 2000; Боярский К. Ю. 2001; Weestergaad L. et al. 2004; Erickson G. et al. 2007 и другие).

В настоящее время сохраняется пристальное внимание к локальным регуляторным механизмам. Именно им принадлежит определяющая роль в селекции фолликулов, генезе атрезии, ановуляторных состояний и бесплодия. Среди ведущих влияний этих механизмов: различия в активности рецепции фолликулами гонадотропных гормонов, разные уровни интрафолликулярного синтеза эстрадиола, неравноценное гемообеспечение фолликулярных регионов и многое другое. (Zeleznik A.J. 1981; Shipper I., Hop W. and Fauser B. 1998; Stouffer R., Dahl K. 2002 и др).

К таким местным модуляторным механизмам относятся, неспецифичекие факторы роста и многочисленные внутриклеточные белки - регуляторы процессов пролиферации и апоптоза. Наиболее яркими и информативным белками, отражающими протекающие синтетические процессы в клетках и тканях, являются белки Кi-67 и PCNA. К белкам, регулирующим процессы апоптоза, относятся белки семейства Bс1-2, р-53, каспазы. В исследованиях последних лет уделено большое внимание экспрессии этих белков и факторов элементами яичника. Наиболее широко изучается пролиферативная активность, механизмы клеточных иммунологических взаимодействий, механизмы апоптоза клеток созревающих и атрезирующихся фолликулов (Huirne J. and Lambalk C. 2001; Gougeon L. 2004; Butt A.J., Dickson K.A., Jambazov S. et al. 2005; Dragovic R.A., Ritter L.J. 2005; McNatty K.P., Fidler A.E. 2006 и другие).

С вопросом фолликулярной селекции тесно сопряжено и дальнейшее исследование систем передачи гормональных сигналов в соматических клетках фолликулярных гистионов, от состояния которых во многом зависит реализация всего комплекса регуляторных сигналов, поступающих в фолликул, включая местные пара- и аутокринные влияния. К таким вторичным мессенджерным системам относятся аденилилциклазная система, фосфатидилинозитольный механизм, принимающий участие в механизме передачи гормональных сигналов соматическим клеткам фолликулов в процессе роста и атрезии (Кулинский В.И. 1997; Волкова О.В., Боровая Т.Г. 2000; Kodaman P.H., Behrman H.R. 2005; Emmen J.M., Couse J.F. 2008 и др).

Цель и задачи исследования

Получить новую информацию о структурно-цитохимической организации фолликулов яичников и их тканевого микроокружения. Выявить внутриклеточные белки и факторы роста в различных структурах яичников и проследить динамику этих химических соединенеий на этапах позитивного и атретического овофолликулогенеза, развития желтых тел.

Для этих целей использовать комплексный морфологический, иммуногистохимический анализ структур яичников:

1. Провести исследование спектра белков, участвующих в процессах пролиферации и регуляции апоптоза в указанных структурах (белки PCNA, Ki-67, Bcl-2, p-53, каспаза-9).

2. Исследовать распределение неспецифических факторов роста (васкулярного эндотелиального, эпидермального, инсулиноподобного фактора роста-1) и оценить их роль в процессе овофолликулогенеза и лютеогенеза.

3. Исследовать состояние внутри- и парафолликулярного матрикса на примере системы матриксных металлопротеиназ-1,9 и тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ-1,2.

4. Исследовать состояние гормонтрансдукторных систем соматических клеток фолликулов (на примере анализа содержания универсальных мессенджерных соединений - -субъединиц G-белков, аденилилциклазы, фосфолипазы С-).

5. Сопоставить активность и количественное распределение исследуемых соединений в структурах фолликулов и их микроокружения, временные параметры их взаимодействия в течение процесса позитивного и атретического овофолликулогенеза, развития желтых тел.

Научная новизна

В настоящей работе впервые проведено комплексное, многогранное изучение распределения химических соединений, выполняющих пара- и аутокринное влияние в обеспечении жизнедеятельности структур яичников: 1)белков клеточной пролиферации и апоптоза (белки PCNA, Ki-67, Bcl-2, p-53, каспаза-9), 2)универсальных ростовых факторов (васкулярного эндотелиального, эпидермального, инсулиноподобного фактора роста-1), 3)системы матриксных металлопротеиназ-1,9 и тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ-1,2, 4)гормонтрансдукторной системы ( -субъединиц G-белков, аденилилциклазы, фосфолипазы С-). Оценены распределение и закономерности синтеза этих соединений в половых клетках, фолликулярном эпителии, клетках желтых тел, в структурах парафолликулярных регионов (в текальных оболочках, интерстиции и кровеносных сосудах) на этапах позитивного и атретического развития фолликулов и желтых тел.

Получены свидетельства о том, что регуляция жизнедеятельности яичников осуществляется не одним специфическим фактором, а экспрессией различных химических соединений, присутствующих в структурных компонентах яичника одновременно и меняющихся в количественном отношении в течении фолликулогенеза. Сочетание комплекса этих факторов обеспечивает адекватную реализацию функционального эффекта в каждый период овофолликуло- и лютеогенеза.

Кроме качественной оценки интенсивности иммуногистохимических реакций нами впервые был проведен сравнительный количественный анализ функциональной активности структур фолликулов и их регионов методом компьютерной морфоденситометрии (КМДМ).

Теоретическая и практическая значимость работы.

Исследование носит экспериментальный характер, направлено на изучение закономерностей овофолликулогенеза и лютеогенеза, оценки механизмов регуляции этих процессов (в частности пара- и аутокринных).

С использованием метода иммуногистохимии получена новая информация о наличии, взаимодействии и динамических преобразованиях важнейших внутриорганных белков (белки PCNA, Ki-67, Bcl-2, p-53, каспаза-9) и ростовых факторов (васкулярного эндотелиального, эпидермального, инсулиноподобного фактора роста-1) в структурах фолликулов (овоцит, фолликулярные клетки), желтых тел и окружающей их гормонпродуцирующей интерстициальной ткани на всех этапах их позитивного и атретического развития. Особенности структуры яичника позволили одновременно визуализировать на серийных срезах исследуемые белки на этапах роста и атрезии фолликулов и желтых тел.

При подробном анализе фолликулогенеза были уточнены наиболее ответственные (круциальные) процессы в химической организации структур яичников, необходимые для поддержания жизнеспособности овоцитов, сохранения блока мейоза, подготовки к овуляции, образованию гормонопродуцирующих желтых тел и атретических фолликулов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Выявлен комплекс факторов - химических соединений, взаимодействие которых обуславливает оптимальность течения процессов роста и атрезии фолликулов и развития желтых тел. Этим местным внутрияичниковым регуляторным факторам принадлежит ключевая роль в физиологическом течении фолликулогенеза и лютеогенеза (они опосредуют и модулируют действия центральных нервных и гуморальных механизмов).

2. Важнейшими компонентами этих химических соединений в овоцитах, фолликулярном эпителии, гормонопродуцирующей интерстициальной ткани, в желтых телах на всех этапах позитивного роста и атрезии являются:

а) группа внутриклеточных белков (PCNA, Ki-67), ответственных за пролиферацию и дифференцировку, индукцию митотической активности;

б) группа внутриклеточных белков (Всl-2, р-53, каспаза-9), осуществляющих контроль за процессами апоптоза в указанных элементах яичника. Интенсивность их экспресси варьирует на этапах фолликулогенеза.

3. Универсальные ростовые факторы (инсулиноподобный-1, васкулярный эндотелиальный, эпидермальный) - перманентные компоненты химической организации овоцитов, фолликулярного эпителия, гормонопродуцирующей интерстициальной ткани и желтых тел яичника. Интенсивность их экспрессии неоднозначна на различных этапах овофолликулогенеза, лютеогенеза и атретических процессов.

4. Выявлена экспрессия матриксных металлопротеиназ (1,9) и их тканевых ингибиторов (1,2) структурами фолликулов, желтых тел и парафолликулярного окружения. Спектр этих соединений меняется в соответствии со стадией развития фолликулов и желтых тел на этапах позитивного и атретического процесса, что свидетельствует об их значении, как региональных механизмов в реаранжировке тканевых структур яичников, обеспечивающих оптимальные условия роста фолликулов и желтых тел.

5. Выявлена закономерность в интенсивности экспрессии компонентов гормонотрансдукторной системы фолликулярного эпителия в процессе развития и созревания фолликулов.

Внедрение в практику. Полученные данные найдут применение в курсах обучения студентов гистологии, эмбриологии, эндокринологии, работе научно-исследовательских лабораторий по репродукции и в клинической практике для разработки новых подходов в оценке гипопластических и дисфункциональных состояний яичников.

Апробация работы. Основные результаты исследования были доложены на I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); Всероссийской научной конференции Человек и лекарство (Москва, 2005); Всероссийской научной конференции Бабухинские чтения в Орле (Орел, 2006); Всероссийском конгрессе гистологов и морфологов (Москва, 2006); на съезде Всероссийского научного общества анатомов, гистологов, эмбриологов (Казань, 2007); совместной научной конференции кафедр гистологии, цитологии, эмбриологии лечебного и педиатрического факультетов РГМУ.

Публикации. Результаты исследования отражены в одиннадцати печатных работах.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 192 источника отечественных и зарубежных авторов. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и иллюстрированы микрофотографиями, графиками, таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на 100 белых беспородных половозрелых самках крыс, находящихся в репродуктивном периоде. В ходе работы применялись следующие варианты обработки экспериментального материала:

Морфологический анализ.

Исследовались серийные срезы яичников толщиной 5 мкм. Подготовку материала для гистологического исследования проводили по общепринятой методике.

Морфологическая оценка состояния гонад крыс основывалась на:

1) анализе популяции фолликулов разных стадий развития (от примордиальных до преовуляторных). Пулы фолликулов идентифицировались на основании Международной классификации (1999).Определение видов фолликулов унифицировано проводилось на сечениях фолликулов, прошедших через ядрышки овоцитов, на каждом пятом срезе серии.

2) анализе желтых тел на разных стадиях развития и регрессии.

3) анализе атрезии фолликулов на разных стадиях атретического процесса (согласно критериям Byskov, 1979).

4) анализе стероидпродуцирующей интерстициальной ткани (по методу С.Б.Стефанова,1974).